組蛋白去乙?；敢种苿┝_米地辛對(duì)小鼠T細(xì)胞表型及功能的影響

田孝軍，徐　晶，蔣繼貧(荊州市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北荊州44000;華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院手術(shù)室，器官移植研究所，湖北，武漢4000)

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組蛋白去乙?；敢种苿┝_米地辛對(duì)小鼠T細(xì)胞表型及功能的影響

田孝軍1，徐晶2，蔣繼貧3△
(1荊州市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北荊州434000;華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院2手術(shù)室，3器官移植研究所，湖北，武漢430030)

［摘要］目的:通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察羅米地辛對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用。方法:取CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度梯度(1、3、5 μmol/L)的羅米地辛及CD3/CD28單抗進(jìn)行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，以僅加入CD3/CD28單抗作為陽(yáng)性對(duì)照組，另設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)72 h后檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。以淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì)照組設(shè)定同上，72 h后檢測(cè)各組中CD4+Foxp3+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞的比例變化。同時(shí)采用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液中相關(guān)細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-10 及TGF-β水平的變化。結(jié)果:羅米地辛劑量依賴性地抑制CD3/CD28單抗誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。在CD3/CD28單抗存在的條件下，1 μmol/L的羅米地辛不能誘導(dǎo)CD4+Foxp3+T細(xì)胞的比例上調(diào)(P＞0.05)。但提高羅米地辛的濃度至3 μmol/L和5 μmol/L后，CD4+Foxp3+T細(xì)胞的比例顯著提高(P＜0.05)。隨著羅米地辛濃度的增加，TNF-α和IL-10水平呈劑量依賴性降低，但各實(shí)驗(yàn)組明顯高于空白對(duì)照組而低于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)。TGF-β在陽(yáng)性對(duì)照組雖稍有升高，但與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。而隨著羅米地辛濃度的增加，TGF-β水平呈劑量依賴性升高，3實(shí)驗(yàn)組間及與空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組間差異顯著(P＜0.05)。結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)研究顯示羅米地辛不僅能夠有效抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，而且一定濃度的羅米地辛可上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，這可能與TGF-β升高有關(guān)，而與IL-10變化無(wú)關(guān)。

［關(guān)鍵詞］組蛋白去乙?；?羅米地辛;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

Influence of histone deacetylase inhibitor romidepsin on phenotype and function of T lymphocytes in vitro

TIAN Xiao-jun1，XU Jing2，JIANG Ji-pin3
(1Intensive Care Unit，The Second Hospital of Jingzhou，Jingzhou 434000，China;2Operation Room，3Institute of Organ Transplantation，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Technology＆Science，Wuhan 430030，China.E-mail: 30503249@ qq.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the effects of romidepsin (FK228)，a novel histone deacetylase inhibitor，on the effector and regulatory T cells in vitro.METHODS: As the reactive cells，lymphocytes，CD4+T cells and CD8+T cells were labelled with CFSE，and stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 mAbs in the presence and absence of different levels of romidepsin (experimental group and positive control group)，or PBS (placebo group).After 72 h，the proliferation of the cells was detected in different groups.The lymphocytes were stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 mAbs in the presence and absence of different levels of romidepsin (experimental group and positive control group)，or PBS (placebo group).After 72 h，the percentage of CD4+Foxp3+T cells and the levels of related cytokines were detected in different groups.RESULTS: The proliferation of CFSE-labelled lymphocytes，CD4+T cells and CD8+T cells triggered by anti-CD3 and anti-CD28 mAbs all were inhibited when cultured with romidepsin at concentrations of 1 μmol/L，3 μmol/L and 5 μmol/L in a dose-dependent manner (P＜0.05).Compared with placebo group，in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 mAbs，1 μmol/L romidepsin did not increase the percentage of CD4+Foxp3+T cells (P＞0.05).When cultured with romidepsin at concentrations of 3 μmol/L and 5 μmol/L，the percentage of CD4+Foxp3+T cells was enhanced markedly (P＜0.05).The levels of IL-10 and TNF-α in the supernatant were markedly increased in positive control groupand 3 experimental groups (P＜0.05)，and the levels of cytokines in different experimental groups were gradually decreased with the elevation of FK228 concentration (P＜0.05).The level of TGF-β was slightly increased in positive control group with no significant difference compared with placebo group (P＞0.05).With the increase in the concentration of FK228 in different experimental groups，the TGF-β level was increased in a dose-dependent manner and there were significant differences in the 3 experimental groups.Meanwhile，significant differences existed between experimental groups and placebo group and between experimental groups and positive control group (P＜0.05).CONCLUSION: Romidepsin inhibits the proliferation of CD4+and CD8+effector T cells and increases the percentage of CD4+Foxp3+regulatory T cells.It may be related to the increased level of TGF-β，but independent of IL-10.

［KEY WORDS］Histone deacetylase; Romidepsin; Regulatory T cells

組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)可逆轉(zhuǎn)與腫瘤相關(guān)的表觀遺傳異常改變，已成為確切的腫瘤治療手段之一［1-2］。近年來(lái)，隨著對(duì)組蛋白去乙酰化酶研究的深入，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HDACi對(duì)于淋巴細(xì)胞還具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，其作為潛在的治療自身免疫性疾病和抗移植排斥藥物的可能性逐漸受到重視［3］。已有文獻(xiàn)證實(shí)作為HDACi的曲古抑菌素(trichostatin，TSA)和辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)等可影響淋巴細(xì)胞的增殖和凋亡等［4］。羅米地辛(romidepsin，F(xiàn)K228)作為新近研發(fā)的HDACi已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤的治療［5］。但對(duì)于其對(duì)正常淋巴細(xì)胞的影響仍缺乏相關(guān)研究。本研究擬在體外小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中，對(duì)其作用加以探討。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)BALB/c小鼠，6～8周齡，體重約20 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所動(dòng)物中心提供。

2主要試劑及儀器

FITC標(biāo)記的抗CD4單抗以及APC標(biāo)記的抗CD8單抗、抗CD3單抗和抗CD28單抗均購(gòu)于Bio-Legend;羅米地辛購(gòu)自Celgene;熒光染料CFSE購(gòu)于Promega; CD4+CD25+Treg流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)于eBioscience; CD4+、CD8+T細(xì)胞磁珠分離試劑盒購(gòu)于MACS。流式細(xì)胞檢測(cè)應(yīng)用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD)。純化的單克隆IL-10抗體、TNF-α抗體、IL-10、TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品和生物素標(biāo)記的Ⅱ抗均購(gòu)自Phar Mingen;親和素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶購(gòu)自Sigma。

3主要方法

3.1淋巴細(xì)胞懸液的制備無(wú)菌條件下切取BALB/c小鼠脾臟，超凈工作臺(tái)下置于盛有淋巴細(xì)胞分離液的培養(yǎng)皿中。以200目尼龍濾網(wǎng)包裹，無(wú)齒彎鑷輕輕擠壓至無(wú)紅色脾組織塊。收集濾液，加入不完全培養(yǎng)基。以800×g密度梯度離心30 min。收集單個(gè)核細(xì)胞層。再用不完全RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次，并調(diào)整終濃度至實(shí)驗(yàn)所需(1×1011/L)。臺(tái)盼蘭染色判定細(xì)胞活力＞95%。

3.2CD4+、CD8+T細(xì)胞的分離收集野生型BALB/c小鼠脾細(xì)胞懸液(約2×108個(gè))，嚴(yán)格按照小鼠CD4亞群、CD8亞群T細(xì)胞磁性分選說(shuō)明書(shū)進(jìn)行陰性分選，得到CD4+或CD8+T細(xì)胞。將分離出的細(xì)胞250×g離心5 min，棄上清，并重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010/L。

3.3 CFSE標(biāo)記將CFDA-SE原液(10 mmol/L)加PBS稀釋制備成5 μmol/L工作液，37℃與實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞)共孵育10 min。完全RPMI-1640終止，并洗滌細(xì)胞1次，經(jīng)37℃預(yù)熱的RPMI-1640重懸標(biāo)記細(xì)胞，再孵育10 min。再次以37℃預(yù)熱的RPMI-1640洗細(xì)胞1次。調(diào)整細(xì)胞的濃度為1×1010/L。

3.4羅米地辛對(duì)淋巴細(xì)胞毒性作用的檢測(cè)取按照以上方法獲得的淋巴細(xì)胞，每孔加入約106個(gè)細(xì)胞。羅米地辛溶于以4∶1混合的丙二醇和乙醇溶液中，初始濃度為5 g/L。再以DMSO稀釋至100 mg/L，并于－20°C儲(chǔ)存。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，分別調(diào)整羅米地辛的培養(yǎng)體系終濃度為1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L。體系為2 mL。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育72 h。72 h后，收集細(xì)胞使用AnnexinⅤ與PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并分析結(jié)果。

3.5淋巴細(xì)胞增殖的檢測(cè)取CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞。將上述細(xì)胞加入72孔培養(yǎng)板中，每孔加5×105個(gè)細(xì)胞(200 μL)。加入濃度依次為1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L到羅米地辛。同時(shí)以加入1 mg/L的抗CD3/CD28單抗作為實(shí)驗(yàn)組;以僅加入抗CD3/CD28單抗刺激的作為陽(yáng)性對(duì)照組;以PBS代替抗CD3/CD28單抗作為空白對(duì)照組。上述各組均培養(yǎng)72 h，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞CFSE熒光強(qiáng)度變化。ModFit LT軟件擬合，得到增殖細(xì)胞各代的百分率，CellQuest軟件分析增殖細(xì)胞比例。

3.6調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及細(xì)胞因子水平的檢測(cè)

取未以CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞，加入72孔培養(yǎng)板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞。分別以終濃度1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L的羅米地辛加入1 mg/L的抗CD3/CD28單抗作為實(shí)驗(yàn)組;以僅加入抗CD3/CD28單抗刺激的作為陽(yáng)性對(duì)照組;以PBS代替抗CD3/CD28單抗作為空白對(duì)照組。上述各組均培養(yǎng)72 h，每組均設(shè)12個(gè)復(fù)孔，其中3個(gè)行Treg細(xì)胞檢測(cè)，3個(gè)行IL-10檢測(cè)，3個(gè)行TGF-β檢測(cè)，3個(gè)行TNF-α檢測(cè)。另外，(1)取上述每孔細(xì)胞，調(diào)整至100 μL體系并加入FITC-CD4單抗、APC-CD25單抗各0.5 μL，4℃避光孵育15 min，PBS清洗;加入Foxp3 Fix/Perm Buffer固定，室溫避光反應(yīng)30 min后，離心棄上清，PBS液洗1次。細(xì)胞再以Foxp3 Fix/Perm Buffer打孔后加入1 μL的PE-Foxp3單抗，室溫避光反應(yīng)30 min; PBS洗并重懸細(xì)胞，調(diào)整終體積至500 μL。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的Foxp3表達(dá)。(2)取上述每孔上清，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法分別檢測(cè)IL-10、TGF-β及TNF-α水平。IL-10、TGF-β或TNF-α單抗包板、封閉、上樣。結(jié)合生物素化抗體，親和素(酶)與生物素結(jié)合，底物顯色。Clinibio全自動(dòng)酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)讀各孔A值，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本濃度。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析檢驗(yàn)各組間差異，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1羅米地辛對(duì)淋巴細(xì)胞毒性作用的檢測(cè)

淋巴細(xì)胞在經(jīng)過(guò)羅米地辛孵育72 h后，通過(guò)檢測(cè)AnnexinⅤ與PI雙陽(yáng)性細(xì)胞比例，查看藥物毒性。通過(guò)至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組之間壞死細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The toxicity of FK228 on lymphocytes growth in vitro.Mean±SD.n=3.圖1體外實(shí)驗(yàn)中羅米地辛對(duì)淋巴細(xì)胞的毒性

2淋巴細(xì)胞增殖的檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，空白對(duì)照組淋巴細(xì)胞未見(jiàn)CFSE增殖峰;而陽(yáng)性對(duì)照組中標(biāo)記細(xì)胞在抗CD3/CD28單抗作用下，出現(xiàn)多個(gè)CFSE增殖峰;在分別加入1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L羅米地辛后，細(xì)胞增殖代數(shù)均出現(xiàn)遞減現(xiàn)象，其中以5 μmol/L羅米地辛組的抑制作用最為明顯，未出現(xiàn)明顯增殖峰;分別給予1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L的羅米地辛后，淋巴細(xì)胞增殖的抑制率分別為39.7%、79.2%和97.6%。同樣，分別給予1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L的羅米地辛也能明顯抑制實(shí)驗(yàn)組效應(yīng)性CD4+、CD8+T細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effects of different concentrations of romidepsin (FK228) on the proliferation of lymphocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs postive control.圖2羅米地辛對(duì)淋巴細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖的影響

3流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞

淋巴細(xì)胞僅受CD3/CD28刺激72 h后，陽(yáng)性對(duì)照組中CD4+Foxp3+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例與空白對(duì)照組相比并無(wú)明顯差異;實(shí)驗(yàn)組中加入1 μmol/L羅米地辛后，CD4+Foxp3+T細(xì)胞的比例并未明顯提高，與空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;然而給予3 μmol/L和5 μmol/L羅米地辛作用后，CD4+Foxp3+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例明顯升高，分別達(dá)到2.93%和8.14%，與空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及1 μmol/L羅米地辛作用的實(shí)驗(yàn)組比較，差異顯著(P＜0.05) ;通過(guò)流式軟件分析，我們發(fā)現(xiàn)Foxp3+T細(xì)胞主要位于CD4+CD25+T細(xì)胞亞群，占80%以上，見(jiàn)圖3。

4細(xì)胞因子TNF-α、IL-10及TGF-β水平的檢測(cè)

淋巴細(xì)胞受CD3/CD28刺激72 h后，細(xì)胞因子TNF-α和IL-10的水平變化陽(yáng)性對(duì)照組較空白對(duì)照組均明顯升高(P＜0.05;而不同實(shí)驗(yàn)組中隨著羅米地辛濃度的增加，TNF-α和IL-10水平呈劑量依賴性降低，但各實(shí)驗(yàn)組TNF-α和IL-10水平明顯高于空白對(duì)照組而低于陽(yáng)性對(duì)照，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而對(duì)于TGF-β檢測(cè)顯示，陽(yáng)性對(duì)照組雖稍有升高，但與空白對(duì)照組相比差異不顯著(P＞0.05)，而不同實(shí)驗(yàn)組中隨著羅米地辛濃度的增加，TGF-β水平呈劑量依賴性升高(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

討論

HDACi是一類具有抗腫瘤活性的新型藥物。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，越來(lái)越多的HDACi被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同，HDACi主要分為短鏈脂肪酸類(丁酸鈉和丙戊酸)、有機(jī)氧肟酸類(TSA和SAHA)、苯甲酰胺類(CI-994和MS-27-275)、環(huán)狀四肽類(trapoxin A )和雙環(huán)肽類(羅米地辛和FR901228)［6］。羅米地辛最早由紫色素桿菌的肉湯培養(yǎng)基中分離得到，同其它HDACi一樣，羅米地辛在成人惡性腫瘤中可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡以及改變基因的表達(dá)，其已被FDA批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)或難治的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCLs)的治療，患者的應(yīng)答率達(dá)50%［7］。但其對(duì)正常免疫系統(tǒng)，尤其是淋巴細(xì)胞的作用仍知之甚少。

有文獻(xiàn)報(bào)告曲古抑菌素A(trichostatin，TSA)通過(guò)腹腔給藥方式作用于小鼠后，對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群具有選擇性抑制作用，并且能抑制混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中T細(xì)胞的增殖和IL-2的表達(dá)［8］。盡管羅米地辛與TSA的作用途徑相同，但其在抑制增殖的效應(yīng)方面是后者的10倍［9］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們以抗CD3單抗聯(lián)合抗CD28單抗模擬同種異基因抗原刺激，在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中，可使后者發(fā)生明顯增殖，表現(xiàn)為CFSE標(biāo)記細(xì)胞出現(xiàn)多個(gè)子代分裂峰。而當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入不同濃度的羅米地辛后，細(xì)胞的增殖受到不同程度抑制。1 μmol/L羅米地辛即表現(xiàn)出顯著的淋巴細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)，抑制率為39.7%，細(xì)胞增殖各子代的百分率亦明顯降低。而且，隨著藥物濃度的提高，抑制作用逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞增殖代數(shù)遞減，細(xì)胞增殖抑制率逐漸提高。同樣地，羅米地辛可以劑量依賴性地抑制CD3/CD28誘導(dǎo)的效應(yīng)性CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，隨著劑量的增加，增殖抑制逐步增強(qiáng)。上述結(jié)果表明，羅米地辛能夠顯著抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖，進(jìn)而下調(diào)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí)，我們對(duì)羅米地辛對(duì)淋巴細(xì)胞毒性的檢測(cè)結(jié)果也表明，1 μmol/L、3 μmol/L和5 μmol/L羅米地辛均不會(huì)對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒性作用。

Figure 3.The changes of CD4+Foxp3+Treg proportion in the lymphocytes cultured in vitro detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3，*P＜0.05 vs positive control group.圖3流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中CD4+Foxp3+Treg的比例

已有的資料已經(jīng)顯現(xiàn)HDACi對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生以及其發(fā)揮免疫抑制功能具有一定的作用［10］。在本研究中，我們將淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，觀察羅米地辛對(duì)Treg細(xì)胞表達(dá)的影響。在抗CD3/CD28單抗存在的情況下，培養(yǎng)體系中加入1 μmol/L羅米地辛并不能誘導(dǎo)CD4+Foxp3+T細(xì)胞比例的升高。但是給予3 μmol/L和5 μmol/L羅米地辛后，CD4+Foxp3+T細(xì)胞的比例顯著增高，且此種作用亦呈現(xiàn)劑量依賴性。此外，流式分析顯示CD4+CD25+T細(xì)胞中Foxp3表達(dá)率在80%以上。此結(jié)果表明，一定濃度的羅米地辛能夠誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg亞群的擴(kuò)增。

效應(yīng)型T細(xì)胞與調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的力量對(duì)比決定了同種異基因免疫應(yīng)答的結(jié)局。羅米地辛在對(duì)T細(xì)胞亞群的作用方面即顯示了雙重性，其不僅能夠抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，而且能夠上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，從而改變效應(yīng)性T細(xì)胞和與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞間的平衡，促使免疫應(yīng)答向著有利于耐受形成的方向發(fā)展。

為了探討在羅米地辛抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖及促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞因子是否發(fā)揮了決定性作用，我們還進(jìn)一步檢測(cè)了相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化。一般認(rèn)為，TNF-α屬于促炎細(xì)胞因子，在促進(jìn)免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮主要作用;而IL-10和TGF-β屬于抗炎細(xì)胞因子，在抑制免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮主要作用［11］。本研究結(jié)果表明，TNF-α在各組中的變化規(guī)律與效應(yīng)T細(xì)胞活化增殖及受抑制的變化規(guī)律完全一致。同樣，TGF-β在空白組與陽(yáng)性對(duì)照組并無(wú)明顯差異，而隨著羅米地辛對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞抑制作用的加強(qiáng)，其水平也有顯著升高，這與CD4+CD25+Foxp3+Treg比例變化的規(guī)律也一致。既往已證實(shí)TGF-β可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞高表達(dá)Foxp3進(jìn)而產(chǎn)生抑制性表型;同時(shí)CD4+CD25+Foxp3+Treg也可受TCR刺激，通過(guò)分泌TGF-β和IL-10而發(fā)揮免疫抑制作用。本研究的結(jié)果提示伴隨著效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，有一定水平的TGF-β升高。而這種TGF-β升高又可以隨著羅米地辛對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的抑制，而導(dǎo)致效應(yīng)性T細(xì)胞高表達(dá)Foxp3，從而分化為CD4+CD25+Foxp3+Treg。同樣，隨著CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的升高，又可以分泌更多的TGF-β，從而進(jìn)一步增強(qiáng)了CD4+CD25+Foxp3+Treg的免疫抑制功能以及提高了比例。然而，對(duì)于IL-10檢測(cè)的結(jié)果顯示隨著效應(yīng)T細(xì)胞的增殖，其水平顯著升高，而隨著羅米地辛對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞抑制作用的加強(qiáng)，其水平并未升高。相反，卻呈進(jìn)行性下降。此結(jié)果表明，羅米地辛所誘導(dǎo)的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例升高，是非IL-10依賴性的。

Figure 4.The changes of IL-10，TNF-α and TGF-β in different groups by ELISA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs placebo group;#P＜0.05 vs positive control group.圖4 ELISA檢測(cè)各組上清液中TNF-α、IL-10及TGF-β水平

目前對(duì)于HDACi在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面的作用仍不夠深入，下一步的研究將著重于探討何種類型的HDACi對(duì)淋巴細(xì)胞的作用最佳，具體的作用方式如何?以及使用何種濃度HDACi可以在抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖的同時(shí)，使體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定、持續(xù)的表達(dá)。

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·短篇論著·

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［收稿日期］2014-07-09［修回日期］2015-04-28

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1099-06

［中圖分類號(hào)］R392.1

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.023