微囊介導(dǎo)VE-Cad胞吞參與了LPS作用后血管通透性增高的形成*

張　曄，張連陽(yáng)，孫士錦，李　陽(yáng)，譚　浩(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷中心，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400042)

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微囊介導(dǎo)VE-Cad胞吞參與了LPS作用后血管通透性增高的形成*

張曄，張連陽(yáng)△，孫士錦，李陽(yáng)，譚浩
(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷中心，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400042)

［摘要］目的:觀察脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作用后微囊介導(dǎo)的血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-Cad)胞吞，及其在血管通透性增高中的作用。方法:采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922，以及免疫組化、免疫印跡、免疫共沉淀等技術(shù)方法，觀察LPS處理后不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞質(zhì)膜微囊重要結(jié)構(gòu)蛋白小窩蛋白1 (caveolin-1，Cav1)的蛋白表達(dá)和磷酸化，Cav1與VE-Cad的共沉淀和共定位，以及微囊抑制劑對(duì)LPS處理后Cav1 與VE-Cad的共沉淀、VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)和單層細(xì)胞通透性的影響。結(jié)果: (1) LPS處理后Cav1蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化，但其Tyr14位點(diǎn)的磷酸化水平逐漸增高(P＜0.05)，Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀逐漸增多(P＜0.05)，免疫組化激光共聚焦顯微鏡觀察在4 h時(shí)可見(jiàn)明顯的共定位; (2)細(xì)胞質(zhì)膜微囊抑制劑非律平(5 mg/L)可以顯著減少LPS處理4 h Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀(P＜0.05)，增強(qiáng)VE-Cad的質(zhì)膜表達(dá)(P＜0.05)，改善單層細(xì)胞通透性(P＜0.05)。結(jié)論:細(xì)胞質(zhì)膜微囊介導(dǎo)VE-Cad胞吞參與了LPS作用后血管通透性增高的形成。

［關(guān)鍵詞］血管通透性增高;脂多糖;血管內(nèi)皮鈣黏蛋白;細(xì)胞質(zhì)膜微囊;小窩蛋白1

［修回日期］2015-03-23

Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad contributes to vascular hyperpermeability after LPS treatment

ZHANG Ye，ZHANG Lian-yang，SUN Shi-jin，LI Yang，TAN Hao
(State Key Laboratory of Trauma，Burns and Combined Injury，Trauma Center of PLA，Institute of Surgery Research，Daping Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400042，China.E-mail: hpzhangly@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe caveolae-mediated endocytosis of vascular endothelial cadherin (VE-Cad) after lipopolysaccharide (LPS) treatment，and its role in vascular hyperpermeability.METHODS: Human vascular endothelial cell line CRL-2922 was used in the experiment.Western blot，co-immunoprecipitation and immunocytochemistry were adopted to observe the protein expression of caveolin-1 (Cav1)，a main structural protein of caveolae，after LPS treatment.Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad after LPS treatment，and the effects of caveolae inhibitor on caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad，the protein expression of VE-Cad and monolayer cell permeability after LPS treatment were determined.RESULTS: After LPS treatment，the protein expression of Cav1 did not show a significant change，while the phosphorylation (Tyr14) of Cav1 was significantly increased (P＜0.05).No co-immunoprecipitation or co-localization of VECad with Cav1 was observed in the normal control，and that was increased time-dependently after LPS treatment (P＜0.05).Filipin，an inhibitor of caveolae，at concentration of 5 mg/L significantly reduced the co-immunoprecipitation of VE-Cad with Cav1 (P＜0.05)，increased the expression of VE-Cad (P＜0.05) in the membrane，and improved the monolayer cell permeability at 4 h after LPS treatment (P＜0.05).CONCLUSION: Caveolae-mediated endocytosis of VECad contributes to the internalization of VE-Cad and the monolayer cell hyperpermeability after LPS treatment.

［KEY WORDS］Vascular hyperpermeability; Lipopolysaccharides; Vascular endothelial cadherin; Caveolae; Caveolin-1

血管通透性增高是嚴(yán)重創(chuàng)傷、膿毒癥患者的重要病理改變，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮屏障受損、對(duì)液體、血漿蛋白、大分子物質(zhì)的通透性增高，導(dǎo)致組織水腫，促進(jìn)內(nèi)環(huán)境紊亂等合并癥發(fā)生。脂多糖(lipopolysac-charide，LPS)是膿毒癥的重要啟動(dòng)因子，研究闡明LPS誘導(dǎo)血管通透性增高的發(fā)生機(jī)制有重要意義。

黏附連接是血管內(nèi)皮細(xì)胞間(除血腦屏障外)的主要連接方式，黏附連接的重要結(jié)構(gòu)蛋白血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-Cad)被胞吞，可以引起黏附連接強(qiáng)度降低、細(xì)胞間隙開(kāi)放和血管通透性增高［1-2］。以往研究認(rèn)為VE-Cad的胞吞主要受網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)［3］，但LPS作用后，網(wǎng)格蛋白重鏈表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞功能減弱［4］。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤上皮細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)膜微囊(簡(jiǎn)稱(chēng)微囊)還可以胞吞黏附連接的重要結(jié)構(gòu)蛋白上皮鈣粘蛋白(epithelial cadherin，E-Cad)，引起連接破壞、細(xì)胞分離和腫瘤轉(zhuǎn)移。

試想，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，如果存在LPS作用下微囊介導(dǎo)的VE-Cad胞吞，勢(shì)必引起黏附連接破壞和細(xì)胞間隙形成，從而可以解釋LPS誘導(dǎo)血管通透性增高的形成。然而迄今尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922，以及免疫組化、免疫印跡、免疫共沉淀等技術(shù)方法，觀察LPS作用后微囊介導(dǎo)的VE-Cad胞吞，及其在血管通透性增高中的作用。

材料和方法

1細(xì)胞培養(yǎng)和接種方式

采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922(ATCC)，在含15%胎牛血清(Gibco)、4.5 g/L葡萄糖、4 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的Dulbecco’s modified Eagle’s培養(yǎng)基(HyClone)中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用于免疫共沉淀和免疫印跡的細(xì)胞接種在25 mL培養(yǎng)瓶中，用于單層細(xì)胞通透性檢測(cè)的細(xì)胞接種在培養(yǎng)小室(Corning)的半透膜上，用于免疫組化的細(xì)胞接種在蓋玻片上。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1LPS處理后小窩蛋白1(caveolin-1，Cav1)與VE-Cad的共沉淀和共定位取生長(zhǎng)至融合的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為正常對(duì)照組、LPS處理1 h組、LPS處理2 h組、LPS處理4 h組及LPS處理6 h組。按照各組要求以LPS(Sigma) 10 mg/L處理并維持不同時(shí)間，檢測(cè)Cav1蛋白表達(dá)和磷酸化，以及Cav1與VE-Cad的共沉淀和共定位。

蛋白及磷酸化檢測(cè)時(shí)，先收集細(xì)胞總蛋白并定量，常規(guī)Western blot技術(shù)檢測(cè)Cav1蛋白表達(dá)和磷酸化(Cav1抗體購(gòu)自Santa Cruz; Cav1 Tyr14位點(diǎn)磷酸化抗體購(gòu)自Cell Signaling)，洗膜后檢測(cè)β-actin (Sigma)表達(dá)，Quantity One軟件分析蛋白條帶，以目標(biāo)蛋白與β-actin吸光度值之比反映其表達(dá)或磷酸化水平。

免疫共沉淀觀察時(shí)，在蛋白裂解液中分別加入VE-Cad抗體(Santa Cruz)和蛋白G-瓊脂糖(Sigma) 4℃過(guò)夜，放射免疫沉淀分析緩沖液(Sigma)洗沉淀并煮沸分離后，常規(guī)Western blot技術(shù)檢測(cè)Cav1表達(dá)，洗膜后檢測(cè)VE-Cad表達(dá)，以Cav1/VE-Cad條帶吸光度值之比反映兩者的共沉淀。

共定位觀察時(shí)，將細(xì)胞經(jīng)過(guò)常規(guī)固定、透化和封閉處理，然后加入VE-Cad和Cav1抗體4℃過(guò)夜，PBS緩沖液洗滌后加入FITC-或羅丹明標(biāo)記的Ⅱ抗(Invitrogen) 37℃孵育1 h，PBS緩沖液洗滌后采用Leica TCS-SP共聚焦顯微鏡觀察熒光圖像，以2種熒光的重疊反映兩者的共定位。

2.2微囊抑制劑非律平(Santa Cruz)對(duì)LPS處理后Cav1與VE-Cad的共沉淀、VE-Cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)和單層細(xì)胞通透性的影響取生長(zhǎng)至融合的CRL-2922細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為正常對(duì)照組、LPS處理4 h組、微囊抑制劑非律平+ LPS處理4 h組，所用非律平濃度為5 mg/L，并按實(shí)驗(yàn)組要求以LPS(10 mg/L)處理4 h，檢測(cè)Cav1與VE-Cad的共沉淀、VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)和單層細(xì)胞通透性。

收集細(xì)胞檢測(cè)VE-Cad質(zhì)膜表達(dá)，采用質(zhì)膜蛋白提取試劑盒(Abcam)提取胞漿和質(zhì)膜蛋白，常規(guī)Western blot技術(shù)檢測(cè)質(zhì)膜蛋白中VE-Cad(1∶200)表達(dá)，胞漿蛋白中檢測(cè)β-actin表達(dá)，以質(zhì)膜VE-Cad與β-actin吸光度值之比反映其表達(dá)水平。

取細(xì)胞生長(zhǎng)融合的培養(yǎng)小室檢測(cè)單層細(xì)胞通透性，按照實(shí)驗(yàn)組要求進(jìn)行處理完畢后，在培養(yǎng)小室的上腔液中加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記牛血清白蛋白(FITC-BSA)作為示蹤劑(Sigma)，在下腔液中取樣，間隔15 min取樣1次，共累計(jì)2 h，檢測(cè)下腔液樣品的熒光強(qiáng)度，計(jì)算累計(jì)熒光透過(guò)率反映單層細(xì)胞通透性。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組內(nèi)自身對(duì)照和配對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 LPS處理后不同時(shí)點(diǎn)的Cav1蛋白表達(dá)和磷酸化變化

LPS處理后，微囊主要的蛋白成分Cav1的蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化，但其Tyr14位點(diǎn)磷酸化水平卻逐漸增高(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The protein expression and phosphorylation (Tyr14) of Cav1 after LPS treatment.Mean±SD.n=4.#P＜0.05 vs control group.圖1 LPS處理后不同時(shí)點(diǎn)的Cav1蛋白表達(dá)和磷酸化

2 LPS處理后的Cav1與VE-Cad的共沉淀和共定位

Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀在正常對(duì)照組中幾乎未見(jiàn)，隨著LPS處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多(P＜0.05)。免疫組化激光共聚焦顯微鏡觀察其共定位也發(fā)現(xiàn)在4 h有明顯的共定位，見(jiàn)圖2。

3微囊抑制劑對(duì)LPS處理后Cav1與VE-Cad的共沉淀、VE-Cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)和單層細(xì)胞通透性的影響

微囊抑制劑非律平(5 mg/L)可以顯著減少LPS處理4 h時(shí)Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀(P＜0.05)，增強(qiáng)VE-Cad的質(zhì)膜表達(dá)(P＜0.05)，改善單層細(xì)胞通透性，使熒光通透率從4 h的70.4%降低至44.9%(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

討論

微囊又稱(chēng)外胞漿膜泡，是細(xì)胞膜表面直徑約50～100 nm的細(xì)頸瓶樣膜結(jié)構(gòu)。在內(nèi)皮細(xì)胞中密度尤其高，占細(xì)胞體積的20%，Cav1是非肌性細(xì)胞中微囊發(fā)揮重要生理功能所必須的結(jié)構(gòu)蛋白［5］。微囊最基本的功能是胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)，可胞吞白蛋白并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞對(duì)側(cè)，是生理情況下白蛋白等大分子物質(zhì)進(jìn)出毛細(xì)血管的主要通道。

Figure 2.Co-immunoprecipitation and co-localization of VE-Cad with Cav1 after LPS treatment.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control group.圖2 LPS處理后的Cav1與VE-Cad的共沉淀和共定位

以往研究發(fā)現(xiàn)，微囊可以在人表皮樣癌細(xì)胞以及胰腺導(dǎo)管癌上皮細(xì)胞，胞吞上皮細(xì)胞間黏附連接的重要結(jié)構(gòu)蛋白E-Cad，引起連接破壞、細(xì)胞分離和腫瘤轉(zhuǎn)移［6-7］。但是否能胞吞VE-Cad從而調(diào)節(jié)血管通透性尚不清楚。僅有相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，用不同濃度(0.05～0.8 mmol/L)的過(guò)氧化氫作用于小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，可導(dǎo)致Cav1的第14位酪氨酸(Tyr14)磷酸化水平增高2～9倍，作用后30 min達(dá)到最高，同時(shí)伴隨著黏附連接復(fù)合物VE-Cad/β-catenin分離、細(xì)胞間黏附連接破壞［8］，提示微囊胞吞與VE-Cad解離、黏附連接破壞具有某種關(guān)聯(lián)。

Figure 3.The effects of caveolae inhibitor on caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad，the protein expression of VE-Cad and monolayer cell permeability after LPS treatment.Mean±SD.n=3～6.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs LPS 4 h group.圖3微囊抑制劑對(duì)LPS處理后Cav1與VE-Cad的共沉淀、VE-Cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)和單層細(xì)胞通透性的影響

我們采用細(xì)胞免疫組化和免疫共沉淀等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)LPS處理后Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀逐漸增多，免疫組化激光共聚焦顯微鏡觀察也發(fā)現(xiàn)在4 h有明顯的共定位;微囊抑制劑非律平可以顯著減少LPS處理4 h時(shí)Cav1與VE-Cad的免疫共沉淀，增強(qiáng)VE-Cad的質(zhì)膜表達(dá)，改善單層細(xì)胞通透性。提示微囊介導(dǎo)VE-Cad胞吞參與了LPS作用后血管通透性增高的形成。

LPS引起血管通透性增高主要有2條途徑，一是“細(xì)胞間”途徑，通過(guò)刺激炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，使內(nèi)皮細(xì)胞張力絲形成并收縮，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附連接破壞、細(xì)胞間隙增大、血管通透性增高［9］;二是“跨細(xì)胞”途徑:通過(guò)微囊對(duì)大分子物質(zhì)的直接胞吞，導(dǎo)致血管通透性增高［10］?！凹?xì)胞間”途徑開(kāi)放是血管通透性增高的主要原因［11］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，盡管如此，“跨細(xì)胞”途徑的微囊可以通過(guò)胞吞“細(xì)胞間”途徑的重要門(mén)控分子VE-Cad，開(kāi)放“細(xì)胞間”途徑，促進(jìn)血管通透性增高的形成，提示“跨細(xì)胞”途徑和“細(xì)胞間”途徑之間存在交互作用，從而補(bǔ)充了對(duì)這兩條途徑功能的認(rèn)識(shí)。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在LPS作用后微囊胞吞VE-Cad的過(guò)程中，Cav1的表達(dá)無(wú)明顯變化，但磷酸化程度顯著增高。以往的文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)微囊的胞吞功能取決于Cav1的磷酸化程度，在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，利用基因技術(shù)使Cav1的磷酸化位點(diǎn)突變，可阻斷激動(dòng)劑引起的微囊對(duì)白蛋白和霍亂毒素B的胞吞作用［12］，那么LPS作用后通過(guò)怎樣的信號(hào)途徑磷酸化Cav1，以調(diào)節(jié)微囊的胞吞功能和血管通透性，尚待進(jìn)一步研究。

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通訊作者△Tel: 023-68757991; E-mail: hpzhangly@163.com

*［基金項(xiàng)目］“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No.2012BAI11B01) ;軍隊(duì)“十二五”重點(diǎn)項(xiàng)目(No.BWS12J033)

［收稿日期］2014-12-10

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1070-05

［中圖分類(lèi)號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.018