加減一陰煎改善去勢大鼠內(nèi)皮功能紊亂*

徐靜婷，曹婭麟，鄭文暉，張亞星，王　玲，王庭槐(中山大學中山醫(yī)學院生理教研室，廣東廣州510080)

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加減一陰煎改善去勢大鼠內(nèi)皮功能紊亂*

徐靜婷，曹婭麟，鄭文暉，張亞星，王玲，王庭槐△
(中山大學中山醫(yī)學院生理教研室，廣東廣州510080)

［摘要］目的:探討加減一陰煎對去勢大鼠內(nèi)皮功能紊亂的影響。方法:采用血管張力儀測定SD大鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能，掃描電鏡觀察胸主動脈內(nèi)皮細胞形態(tài)，Western blotting技術檢測內(nèi)皮脂肪酶的表達，HE染色觀察大鼠子宮內(nèi)膜的形態(tài)。結果:加減一陰煎逆轉了去勢大鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能的降低;加減一陰煎減少了去勢大鼠內(nèi)皮細胞脂質(zhì)的堆積，降低了去勢大鼠內(nèi)皮脂肪酶的表達水平;加減一陰煎對去勢大鼠子宮濕重的影響不大。結論:加減一陰煎可改善去勢大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能，維持內(nèi)皮細胞形態(tài)的完整。

［關鍵詞］加減一陰煎;戊酸雌二醇;內(nèi)皮依賴性舒張;內(nèi)皮脂肪酶

［修回日期］2015-04-24

Effect of Jia-jian-yi-yin decoction on endothelial dysfunction in ovariectomized female rats

XU Jing-ting，CAO Ya-lin，ZHENG Wen-hui，ZHANG Ya-xing，WANG Ling，WANG Ting-huai
(Department of Physiology，Zhongshan School of Medicine，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail: wangth@ mail.sysu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of Jia-jian-yi-yin decoction on endothelium-dysfunction in ovariectomized rats.METHODS: The ovariectomized rats were treated with Jia-jian-yi-yin decoction or turbid liquid of estradiol valerate for 8 weeks.The vascular ring tension was measured.Scanning electron microscopy and Western blotting were applied to assess the function of endothelium-dependent dilation，aortic endothelial morphology and the expression of endothelial lipase.The pathologic sections were prepared to observe the effect of Jia-jian-yi-yin decoction on the uterus.RESULTS: In ovariectomized rats，the decrease in endothelium-dependent relaxation to acetylcholine (ACh) was reversed to normal level，the endothelial morphology returned to normal without lipid accumulation and the endothelial lipase expression was decreased by Jia-jian-yi-yin decoction.Furthermore，no obvious change of the wet weight of uterine between the ovariectomized rats with or without Jia-jian-yi-yin decoction treatment was observed.CONCLUSION: Jia-jian-yi-yin decoction may have protective effects on endothelium-dependent vasodilation and aortic endothelial morphology in estrogen-deficient animals.

［KEY WORDS］Jia-jian-yi-yin decoction; Estradiol valerate; Endothelium-dependent dilation; Endothelial lipase

動脈粥樣硬化是嚴重威脅人類健康的心血管疾病之一［1］。絕經(jīng)期婦女動脈粥樣硬化疾病的發(fā)病率顯著升高，內(nèi)皮功能紊亂是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)［2］，因此，維持內(nèi)皮細胞的正常功能或及時逆轉內(nèi)皮功能紊亂為防治動脈粥樣硬化的有效措施。雌激素(estrodiol，E2)具有心血管保護作用，然而，絕經(jīng)后婦女長期補充雌激素可增加癌癥發(fā)生風險，因此人們將目光投向具有擬雌激素樣作用且副作用較少的植物雌激素。

加減一陰煎可追溯到明代(公元1642年)由張景岳所著的《景岳全書》，主要功效為滋陰清熱［3］?，F(xiàn)代知名老中醫(yī)王飛翔先生在多年的臨床實踐中，將加減一陰煎用于治療女子月經(jīng)不調(diào)且療效顯著。加減一陰煎由11味中藥經(jīng)水煎而成，我室前期細胞實驗結果表明加減一陰煎具有擬雌激素樣作用，可促進血管內(nèi)皮細胞的增殖及一氧化氮的釋放從而發(fā)揮血管保護作用［4］，而加減一陰煎于在體實驗中對血管內(nèi)皮細胞的作用尚不清楚，因此本實驗旨在觀察加減一陰煎對去勢大鼠內(nèi)皮功能紊亂及內(nèi)皮細胞形態(tài)的影響。

材料和方法

1材料

1.1中藥組分熟地、地骨皮、生地、知母、麥門冬、丹參、川芎、黃精、牛膝、芍藥和甘草購自中山大學附屬第一醫(yī)院中藥房。

1.2動物8月齡SD雌性大鼠40只，重(340± 10) g，購自廣東省實驗動物中心，合格證號為SCXK(粵) 2011-0029。

1.3主要儀器Myodap血管環(huán)張力儀購自Danish Myo Technology A/S;掃描電子顯微鏡QUANTA200購自FEI; Western blotting凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad。

1.4主要試劑乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)和硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)購自Sigma;苯腎上腺素(phenylephrine，PE)購自上海禾豐藥業(yè)有限公司;戊酸雌二醇購自仙靈藥業(yè)有限公司;內(nèi)皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)抗體購自Santa Cruz。SDS配膠試劑購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司; Western blotting發(fā)光液購自普萊利生物技術有限公司。

2主要方法

2.1加減一陰煎的制備將熟地、地骨皮、生地、知母、黃精、牛膝、芍藥、甘草等11味中藥用清水浸泡0.5 h后微火熬制1 h即可。之后將2煎中藥分別熬制2次后的水煎液凍干稱重，得出成人每日用量的平均值為37.55 g。根據(jù)大鼠與人體表面積折算的等效劑量為0.018的比值換算，得出大鼠每日的給藥量為3.38 g/kg。

2.2卵巢摘除大鼠模型的制備10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，術野剪毛、消毒、鋪巾，經(jīng)腹背部肋緣下1 cm，脊柱兩側各1 cm交界處，分別切2個1 cm左右的切口，鈍性分離肌肉，剪開腹膜，于腹腔脂肪中找到菜花樣卵巢結扎并切除雙側卵巢，對照組不作任何處理，術后腹腔注射青霉素3 d預防感染。術后1周行陰道涂片檢查，以不出現(xiàn)角化上皮細胞為造模成功。

2.3給藥方式將大鼠隨機分為正常對照組(MC)、去勢組(MO)、加減一陰煎組(MY)和戊酸雌二醇組(ME)。動物模型制備成功后，將加減一陰煎凍干粉和碾成粉末的戊酸雌二醇分別溶于3 mL雙蒸水中，給予處理組大鼠每日以中藥3.38 g/kg或戊酸雌二醇1.2 mg/kg的劑量連續(xù)灌胃2個月［5］。對照組給予3 mL的雙蒸水灌胃，去勢組不做任何處理。之后處死大鼠，取血清和胸主動脈保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4血管環(huán)張力的測定大鼠麻醉后，打開胸腔并迅速分離胸主動脈，立即置于預冷的Krebs液，去除血管上的脂肪及結締組織，將動脈剪成長約2 mm的血管環(huán)，置于10 mL含Krebs液的器官小室中。2根細金屬絲分別由血管內(nèi)腔穿過血管環(huán)，并固定于血管張力儀兩端的肌動描記器裝置上，將溫度設定在37℃，持續(xù)充以95% O2和5% CO2的混合氣體。平衡60～90 min，期間每隔15～20 min換液1次。實驗血管先用10－6mol/L PE鑒別血管收縮活性，用10－5mol/L ACh檢測內(nèi)皮完整性，對ACh舒張大于70%認為內(nèi)皮完整。沖洗血管環(huán)再次平衡至基線水平，然后進行實驗。按以下公式計算舒張率:舒張率(%)=(最大預收縮的張力－舒張時的張力)/最大預收縮的張力。

2.5掃描電鏡觀察大鼠稱重麻醉后，暴露并迅速分離胸主動脈，立即置于預冷的PBS液，小心剝離血管上的脂肪及結締組織，暴露內(nèi)皮層，并置于4%的多聚甲醛中過夜，經(jīng)脫水、CO2臨界點干燥、金屬鍍膜處理樣品，于3 000倍掃描電子顯微鏡下觀察內(nèi)皮細胞。

2.6 Western blotting實驗將保存的胸主動脈組織加入裂解液，于超聲粉碎機下勻漿組織塊，煮蛋白18 min，13 500 r/min于4℃環(huán)境下離心7 min，取上清－20℃保存。常規(guī)BCA方法蛋白定量。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，進行SDS-PAGE 1.5～2 h，在4℃環(huán)境下轉膜60 min，將蛋白轉移至PVDF膜上。室溫5% BSA封閉30 min，加Ⅰ抗(endothelial lipase，1∶1 000;β-actin，1∶2 000)預孵PVDF膜4℃過夜，TBST洗膜3次，加Ⅱ抗孵育1 h，TBST洗膜后在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Image Lab軟件分析條帶灰度，每次實驗將對照組蛋白灰度值標準化為100%。

2.7 HE染色取新鮮的大鼠子宮組織并立即置于10%的甲醛溶液中固定，脫水浸蠟包埋。石蠟切片脫蠟，PBS沖洗。蘇木素液浸染5 min，流水沖洗1 min，1%鹽酸乙醇分化3 s，自來水返藍。1%伊紅染液2 min，中性樹膠封片。

2.8血清生化指標檢測血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、總甘油三酯(total triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平及雌激素(estradiol，E2)水平的測定均使用日立Hitachi 7180全自動生化分析儀，由中山大學附屬第一醫(yī)院檢驗科測得。

3統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。實驗重復3次，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1加減一陰煎對去勢大鼠內(nèi)皮依賴性舒張(endothelium-dependent dilation，EDD)功能的影響

正常對照組、去勢組、加減一陰煎組和E2組的最大內(nèi)皮依賴性舒張率分別為(72.07±1.50) %、(42.78±3.57) %、(73.37±2.27) %和(73.26± 2.76) %，加減一陰煎組和雌激素組逆轉了去勢大鼠EDD的降低。各組對SNP的最大舒張率分別為(75.43±2.92) %、(72.00±1.85) %、(74.76± 3.03) %和(75.10±2.02) %，組間無顯著差異，見圖1。

Figure 1.Effects of Jia-jian-yi-yin decoction on endothelium-dependent dilation of thoracic aorta in ovariectomized rats.A: the dilation of thoracic aorta to ACh; B: the maximal ACh dilation; C: the dilation of thoracic aorta to SNP; D: the maximal SNP dilation.MC: middle-aged control; MO: middle-aged rats with ovariectomy; MY: middle-aged OVX rats treated with Jia-jianyi-yin decoction; ME: middle-aged OVX rats treated with estradiol valerate.Mean±SD.n=4～5.＊＊P＜0.01 vs MC.圖1加減一陰煎對去勢大鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響

2加減一陰煎對血管內(nèi)皮細胞形態(tài)的影響

掃描電鏡結果顯示，與正常對照組相比，去勢組內(nèi)皮細胞排列紊亂，局部內(nèi)皮層充滿疏水性的球形脂滴樣物質(zhì)，內(nèi)皮細胞表面的微絨毛不明顯。加入雌激素后，內(nèi)皮細胞形態(tài)完好，排列整齊，細胞表面微絨毛豐富;補充加減一陰煎后，內(nèi)皮細胞排列整齊，形態(tài)完好，細胞表面微絨毛豐富，與戊酸雌二醇組類似，見圖2。

Figure 2.The observation of endothelial cells under scanning electron microscope.Red hollow triangles: lipid substances; yellow hollw arrows: microvilli.圖2加減一陰煎對去勢大鼠血管內(nèi)皮細胞形態(tài)的影響

3加減一陰煎對內(nèi)皮脂肪酶表達的影響

Western blotting結果顯示，與正常對照組相比，去勢組內(nèi)皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)表達水平升高，加減一陰煎與戊酸雌二醇均可降低EL的表達(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The relative endothelial lipase expression.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs MC;#P＜0.05 vs MO.圖3加減一陰煎對內(nèi)皮脂肪酶表達的影響

4加減一陰煎對去勢大鼠體重、血清E2和血脂水平的影響

正常對照組、去勢組、加減一陰煎組和戊酸雌二醇組的體重分別為(386.67±5.77) g、(467.50± 43.49) g、(370.00±14.72) g和(385.00±32.79) g。各組的血清雌激素水平分別為(525.54±18.99) pmol/L、(318.16±21.20 ) pmol/L、(321.71± 49.59) pmol/L和(530.96±30.01) pmol/L。TC/HDL-C與TG/HDL-C的比值在去勢組明顯升高，加減一陰煎組與戊酸雌二醇組均降低此比值(P＜0.05)，見表1。

5加減一陰煎對子宮增生的影響

正常對照組、去勢組、加減一陰煎組和戊酸雌二醇組的子宮濕重分別為(0.56±0.11) g、(0.14± 0.02) g、(0.13±0.01) g和(0.45±0.08) g，見圖4; HE染色結果顯示:與正常對照組相比，去勢組子宮內(nèi)膜上皮細胞萎縮為扁平細胞;雌激素組子宮內(nèi)膜上皮增生呈柱狀，且出現(xiàn)核下空泡;加減一陰煎組子宮內(nèi)膜柱狀上皮細胞部分萎縮，局部萎縮呈扁平狀，見圖5。

討論

動脈粥樣硬化嚴重威脅著絕經(jīng)期婦女的生命健康安全，內(nèi)皮功能紊亂是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)，內(nèi)皮細胞釋放的NO減少是內(nèi)皮功能紊亂的重要特征［6］。在本實驗中，我們選用8月齡雌鼠去勢1個月給藥以模擬絕經(jīng)后婦女的低雌激素狀態(tài)［7］，使用ACh檢測EDD。本實驗結果表明，與對照組相比，去勢組EDD明顯降低，加減一陰煎可逆轉去勢大鼠的EDD，而中藥組與戊酸雌二醇組無差別。使用SNP檢測血管舒張功能，結果顯示各組對SNP直接舒張血管平滑肌的反應無差異，表明去勢組EDD明顯降低主要與血管內(nèi)皮細胞功能受損有關;加減一陰煎改善去勢大鼠的EDD主要通過作用于內(nèi)皮細胞而非平滑肌細胞，此作用與雌激素改善去勢大鼠的EDD類似;這提示加減一陰煎在改善去勢大鼠EDD方面具有擬雌激素樣作用。

表1　加減一陰煎對去勢大鼠體重、血清E2和血脂水平的影響Table 1.Effects of Jia-jian-yi-yin decoction on the basic data of the rats with different treatments (Mean±SD.n=4～6)

Figure 4.The wet weight of uterine.Mean±SD.n=5～10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs MC;##P＜0.01 vs MO.圖4加減一陰煎對子宮濕重的影響

Figure 5.The HE staining of uterine (×400).圖5加減一陰煎對子宮內(nèi)膜的影響

去勢大鼠EDD的降低與內(nèi)皮細胞密切相關，且藥物被吸收入血后與血管內(nèi)皮細胞直接相接觸，因此我們檢測了主動脈的舒張功能后，在電鏡下觀察了血管內(nèi)皮細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，去勢組內(nèi)皮細胞排列紊亂，且局部內(nèi)皮層充滿疏水性的脂滴樣物質(zhì)，提示去勢組EDD的降低與其內(nèi)皮細胞形態(tài)受損相關，印證了去勢組EDD的降低;加減一陰煎組及戊酸雌二醇組內(nèi)皮細胞排列相對整齊，接近對照組水平，且脂滴樣物質(zhì)明顯減少，提示加減一陰煎在改善去勢大鼠內(nèi)皮細胞形態(tài)方面也具有擬雌激素樣作用，同時也印證了加減一陰煎逆轉去勢大鼠EDD的降低。值得一提的是，去勢組內(nèi)皮層局部出現(xiàn)了脂滴樣物質(zhì)，我們推測加減一陰煎及戊酸雌二醇改善去勢大鼠內(nèi)皮細胞形態(tài)的原因之一應與逆轉去勢大鼠內(nèi)皮細胞脂質(zhì)堆積的現(xiàn)象有關。

脂質(zhì)代謝在動脈粥樣硬化的進展中發(fā)揮重要作用，雌激素發(fā)揮血管保護作用的途徑之一為調(diào)節(jié)血脂水平，降低LDL，升高HDL［8］。以上結果證實加減一陰煎可保護血管的形態(tài)和功能，是否也與調(diào)節(jié)血脂有關呢?本實驗血脂結果顯示，加減一陰煎和戊酸雌二醇組血脂HDL水平與對照組相比變化不大［9］，去勢組HDL水平出現(xiàn)短暫代償性升高。據(jù)報道TC/HDL-C和TG/HDL-C的比值預測心血管系統(tǒng)疾病比單純血清HDL及LDL水平更有價值［10］，在本實驗中，與正常對照組相比，去勢組TC/HDL-C和TG/HDL-C比值顯著升高，而中藥組及戊酸雌二醇組均降低兩比值至對照組水平，表明加減一陰煎的作用類似戊酸雌二醇，可改善血脂水平。

血脂中的HDL具有良好的心血管保護作用，逆向轉運血管中的膽固醇需定位在其表面，而內(nèi)皮脂肪酶可作為內(nèi)皮細胞與脂質(zhì)間連接的橋梁，除了橋接功能，EL還可水解HDL的磷脂［11］。在正常生理情況下，EL由血管內(nèi)皮細胞少量合成;而在動脈粥樣硬化的血管中，EL表達增加［12］。因此我們推測去勢組大鼠血管內(nèi)皮細胞表面脂質(zhì)堆積的現(xiàn)象可能與EL相關。免疫印跡結果顯示，加減一陰煎和戊酸雌二醇均可降低去勢大鼠EL的表達，表明加減一陰煎對EL的作用也與雌激素類似。這提示加減一陰煎逆轉去勢大鼠內(nèi)皮層脂質(zhì)堆積的現(xiàn)象可能與EL表達下調(diào)有關，使得功能性的HDL逆轉運膽固醇正常，內(nèi)皮細胞對脂質(zhì)的攝取利用與排出達到平衡。

在本實驗中，從血管舒張功能及形態(tài)觀察結果中我們證實，加減一陰煎對血管的保護具有擬雌激素樣作用，但絕經(jīng)后婦女補充雌激素后卻伴隨如子宮內(nèi)膜癌［13］、靜脈血栓［14］等副作用，加減一陰煎是否也具有類似的副作用還未可知。本實驗中，我們選取子宮組織觀察其增生情況，結果顯示，雌激素可促進去勢大鼠的子宮內(nèi)膜增生，加減一陰煎則對去勢大鼠子宮內(nèi)膜的增生影響不大，這提示中藥對子宮不具有擬雌激素樣作用。有研究表明，加減一陰煎中的熟地［15］、地骨皮［16］、知母［17］等中草藥中不僅含有黃酮類、香豆素類、三萜類等植物雌激素，也含有生物堿(如甜菜堿［18］)、甾體皂苷(如知母皂苷［17］)等其它非植物雌激素成分。而加減一陰煎中的何種成分可抑制子宮內(nèi)膜的增生及其作用機制還有待我們進一步探討。

綜上所述，加減一陰煎可改善去勢大鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能(EDD)，維持內(nèi)皮細胞形態(tài)的完整，且對子宮內(nèi)膜的增生影響不大，這為絕經(jīng)后婦女提供一種更安全、更有效的治療選擇，具有一定的臨床意義。［參考文獻］

［1］Turdi S，Huff AF，Pang J，et al.17-beta estradiol attenuates ovariectomy-induced changes in cardiomyocyte contractile function via activation of AMP-activated protein kinase［J］.Toxicol Letters，2014，232(1) :253-262.

［2］Chen C，Ochoa LN，Kagan A，et al.Lysophosphatidic acid causes endothelial dysfunction in porcine coronary arteries and human coronary artery endothelial cells［J］.Atherosclerosis，2012，222(1) :74-83.

［3］張介賓.景岳全書［M］.第1版.杭州:浙江古籍出版社，2013:卷五十一·補陣.

［4］陳莎麗.加減一陰煎對血管內(nèi)皮細胞的作用及其機制［D］.廣州:中山大學，2007.

［5］謝榮凱，連楊.戊酸雌二醇對去勢大鼠子宮雌激素受體亞型表達的影響［J］.實用醫(yī)學雜志，2008，24 (21) :3643-3645.

［6］Esper RJ，Nordaby RA，Vilarino JO，et al.Endothelial dysfunction: a comprehensive appraisal［J］.Cardiovasc Diabetol，2006，5:4.

［7］Zhen P，Zhao Q，Hou D，et al.Genistein attenuates vascular endothelial impairment in ovari-estomized hyperhomocysteinemic rats［J］.J Biomed Biotechnol，2012，2012 (2012) :1-10.

［8］Schnatz PF，Schnatz JD.Dyslipidemia in menopause: mechanisms and management［J］.Obstet Gynecol Surv，2006，61(9) :608-613.

［9］鄭高利，張信岳，鄭經(jīng)偉，等.葛根異黃酮降低雌性去勢大鼠血膽固醇水平［J］.中藥材，2002，25(4) : 273-275.

［10］吳燕丹.TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C與冠心病不同程度相關性［J］.臨床誤診誤治，2014，27(6) : 64-67.

［11］Hirata K，Dichek HL，Cioffi JA，et al.Cloning of a unique lipase from endothelial cells extends the lipase gene family［J］.J Biol Chem，1999，274 (20) :14170-14175.

［12］Yasuda T，Ishida T，Rader DJ.Update on the role of endothelial lipase in high-density lipoprotein metabolism，reverse cholesterol transport，and atherosclerosis［J］.Circ J，2010，74(11) :2263-2270.

［13］Ulrich LS.Endometrial cancer，types，prognosis，female hormones and antihormones［J］.Climacteric，2011，14 (4) :418-425.

［14］Scarabin PY.Hormones and venous thromboembolism among postmenopausal women［J］.Climacteric，2014，17 (S2) :34-37.

［15］劉彥飛，趙宇，武衛(wèi)紅，等.地黃的化學成分及其在加工炮制過程中的變化［J］.國外醫(yī)藥:植物藥分冊，2007，22(3) :102-108.

［16］韓偉，金凌潔，孫曉海.地骨皮中黃酮類化合物的吐溫-80協(xié)同超聲提?。跩］.南京工業(yè)大學學報，2012，34(4) :105-109.

［17］趙路路，劉菲菲，彭纓.高效液相色譜法考察不同炮制方法對知母中5種主要化學成分的影響［J］.色譜，2012，30(12) :1271-1275.

［18］魏秀麗，梁敬鈺.地骨皮的化學成分研究［J］.中草藥，2003，34(7) :580-581.

通訊作者△Tel: 020-87330647; E-mail: wangth@ mail.sysu.edu.cn

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.81172525) ;廣東省科技廳項目(No.2012A032500002)

［收稿日期］2015-02-07

［文章編號］1000-4718(2015)06-1008-06

［中圖分類號］R363; R289.51

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.008