嗜高溫灰樹花工廠化生產(chǎn)菌株的篩選研究

馮芳俠，付慶偉，王鳳春，付慶成

(1.遷西縣農(nóng)牧局，河北遷西 064300；2.遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心，河北遷西 064300；3.遷西縣虹泉食用菌專業(yè)合作社，河北遷西 064300)

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嗜高溫灰樹花工廠化生產(chǎn)菌株的篩選研究

馮芳俠1，2，付慶偉2，3，王鳳春2，付慶成3

(1.遷西縣農(nóng)牧局，河北遷西 064300；2.遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心，河北遷西 064300；3.遷西縣虹泉食用菌專業(yè)合作社，河北遷西 064300)

[目的]篩選適合相對(duì)高溫環(huán)境生產(chǎn)出菇的菌種。[方法]通過(guò)比較11個(gè)野生灰樹花菌株的菌絲生長(zhǎng)速率、生長(zhǎng)勢(shì)、拮抗性，并以栽培周期、子實(shí)體品質(zhì)及前期生物學(xué)轉(zhuǎn)化率等為指標(biāo)進(jìn)行工廠化栽培考察。[結(jié)果]菌株“ZDSJ-08”在24～32 ℃生長(zhǎng)溫度層架式栽培方式下，71 d 2次出菇累計(jì)基質(zhì)生物轉(zhuǎn)化率為88.6%；同時(shí)在顏色、風(fēng)味、葉片厚度、口感及朵形等方面表現(xiàn)優(yōu)秀。[結(jié)論]菌株“ZDSJ-08”適合灰樹花高溫工廠化栽培。

灰樹花；高溫；菌株篩選；工廠化

灰樹花[Grifolafrrondosa(Dicks.Fr.)S.F.Gray]是珍貴的藥食兩用菌。人工栽培的歷史較短，受前期生物轉(zhuǎn)化率低、多糖含量低等因素制約，灰樹花栽培成本較高，工廠化生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展緩慢，制約了整個(gè)行業(yè)的發(fā)展。篩選前期生物轉(zhuǎn)化率高、適合高溫環(huán)境出菇的工廠化栽培菌種，能夠滿足夏季及初秋溫度較高環(huán)境下工廠化出菇，又能降低生產(chǎn)成本，可以極大地滿足灰樹花工廠化栽培的需求[1]。筆者通過(guò)比較11個(gè)野生灰樹花菌株的菌絲生長(zhǎng)速率、生長(zhǎng)勢(shì)、拮抗性，并以栽培周期、子實(shí)體品質(zhì)及前期生物學(xué)轉(zhuǎn)化率等為指標(biāo)進(jìn)行工廠化栽培考察，篩選出適合相對(duì)高溫環(huán)境生產(chǎn)出菇的菌種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基配方。

1.1.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g、栗木屑50 g、麥麩50 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、維生素B1 0.01 g、CaH2PO43 g、MgSO41.5 g、瓊脂粉20 g，定容至1 000 ml。

1.1.1.2 原種、栽培種培養(yǎng)基。栗木屑35%、棉籽皮15%、麩皮15%、玉米芯20%、栗蓬10%、海泡石粉2%、蔗糖1%、過(guò)磷酸鈣1%、石膏1%，含水量65%，常壓100 ℃滅菌12 h，即可。

1.1.2 供試菌種及來(lái)源。從唐山市遷西縣東荒峪、漢兒莊等地收集25個(gè)野生菌株，采用組織分離法，取子實(shí)體柄葉結(jié)合部位組織接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，在25 ℃下恒溫培養(yǎng)形成菌落，采用菌絲尖端純化法純化菌種，并用基礎(chǔ)培養(yǎng)基斜面保存?zhèn)溆?，?jīng)過(guò)分離、純化、初篩獲得11個(gè)優(yōu)種，依次編號(hào)為“ZDSJ-01”～“ZDSJ-11”。以當(dāng)?shù)刂髟云贩N‘小黑汀’為對(duì)照，河北省燕山科學(xué)試驗(yàn)站提供。

1.1.3 試劑。木聚糖(Sigma公司)；其他試劑如醋酸鈉、酒石酸鉀鈉、丙酮、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、MgSO4、NaOH等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 主要儀器。UV8100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；梅特勒電子分析天平，河南鄭州南北儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 最適生長(zhǎng)溫度的試驗(yàn)。采用生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定。用基礎(chǔ)培養(yǎng)基做成平板，接種環(huán)挑菌種置于平板中央，分別在18、20、22、24、26、28、30、32 ℃條件下，恒溫培養(yǎng)10 d后，測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理做3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.2 出菇試驗(yàn)。以栗木屑35%、棉籽皮15%、玉米芯20%、麩皮15%、栗蓬10%、海泡石粉2%、蔗糖1%、過(guò)磷酸鈣1%、石膏1%為配方。將栗木屑、棉籽殼、栗蓬渣等主料稱好、混勻，再將麩皮、過(guò)磷酸鈣、蔗糖、石膏等輔料隨水拌入料中，料水比為1∶1.2～1∶1.3，含水量65%，常壓100 ℃滅菌12 h，即可。以主栽品種“小黑汀”為對(duì)照， 與11個(gè)野生優(yōu)種各200棒做對(duì)比試驗(yàn)；采用層架式發(fā)菌，菌絲長(zhǎng)滿菌袋后，剝袋置于生長(zhǎng)畦(長(zhǎng)×寬×深=2 m×0.5 m×0.3 m)內(nèi)，覆土栽培，出菇兩潮為止。分別記錄2次出菇量、出菇溫度、出菇時(shí)間、平均單重、轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)量、顏色、氣味、葉片厚度、產(chǎn)量等指標(biāo)[2-3]。

1.2.3 菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的測(cè)定。以主栽品種“小黑汀”為對(duì)照，將ZDSJ-01、ZDSJ-04和ZDSJ-08等3個(gè)野生優(yōu)種在基礎(chǔ)培養(yǎng)基活化后，沿菌落的邊緣取直徑5 mm的菌塊，分別接種于PDA加富平板培養(yǎng)基上。每個(gè)菌種做3個(gè)重復(fù)，于各自適宜的生長(zhǎng)溫度下恒溫培養(yǎng)3 d，每天定時(shí)觀察菌落的生長(zhǎng)狀況，并精確測(cè)量菌落半徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。菌絲生長(zhǎng)速度(mm/d)=菌落半徑(mm)/菌絲生長(zhǎng)天數(shù)(d)。

1.2.4 木聚糖酶活力測(cè)定。沿菌落邊緣挖取模擬出菇培養(yǎng)基上的菌絲各1 g于試管中，加pH 4.6、0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液10 ml，25 ℃浸提過(guò)夜(12 h)，將浸提液用濾紙過(guò)濾，取濾液1 ml加入試管中，然后加入9 ml的蒸餾水稀釋，充分混勻，得粗酶液待用。將pH 4.6醋酸鈉緩沖溶液、1%木聚糖溶液及粗酶液于40 ℃水浴預(yù)熱2 min，然后在試管中依次加入pH 4.6醋酸鈉緩沖溶液1 ml、1%木聚糖溶液0.5 ml、稀釋后的粗酶液0.5 ml，40 ℃水浴30 min后，加入DNS 3 ml，100 ℃水浴5 min后水冷，波長(zhǎng)510 nm下測(cè)OD值。酶活力以樣品與底物反應(yīng)30 min后吸光值的改變表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適生長(zhǎng)溫度的試驗(yàn)結(jié)果

菌落直徑結(jié)果顯示(表1)，一般灰樹花菌株菌絲體生長(zhǎng)適宜溫度為22～30 ℃，在22 ℃以下或30 ℃ 以上生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)最適溫度為26～28 ℃；ZDSJ-01、04、08在相對(duì)高溫具有較大的生長(zhǎng)量，其中ZDSJ-08能夠在相對(duì)較高(29 ℃)的溫度下達(dá)到很高的生長(zhǎng)量，有較大的應(yīng)用空間。

表1 不同溫度下測(cè)量的菌落直徑 mm

2.2 出菇試驗(yàn)結(jié)果

由表2可見(jiàn)，傳統(tǒng)優(yōu)種“小黑汀”比ZDSJ-08號(hào)優(yōu)種2次出菇總時(shí)間長(zhǎng)12 d，且后者在較高溫度(29 ℃)生物轉(zhuǎn)化率達(dá)88.6%以上；ZDSJ-04號(hào)優(yōu)種也比“小黑汀”早5 d完成出菇，生物轉(zhuǎn)化率同比高6.3%。結(jié)合灰樹花子實(shí)體的特有香氣、灰黑色、葉片厚實(shí)等傳統(tǒng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選優(yōu)種ZDSJ-08具有耐高溫(29 ℃)、前期生物轉(zhuǎn)化率高(88.6%)及較好的產(chǎn)品特性，符合工廠化生產(chǎn)菌種的特征。

2.3 菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的測(cè)定結(jié)果

從表3可看出，4個(gè)灰樹花菌株在PDA加富培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度雖存在一定的差異，但不明顯，生長(zhǎng)速度排列順序?yàn)閆DSJ-08>ZDSJ-04>小黑汀> ZDSJ-01；ZDSJ-04和ZDSJ-08灰樹花優(yōu)種生長(zhǎng)勢(shì)較旺，有粗壯優(yōu)勢(shì)菌絲發(fā)育。

表3 PDA加富的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)

2.4 木聚糖酶活力測(cè)定結(jié)果

與“小黑汀”菌種對(duì)比，ZDSJ-01、ZDSJ-04和ZDSJ-08這3個(gè)篩選的灰樹花菌株的木聚糖酶活力差異明顯，分別為23.96、19.66和23.33 U，均高于對(duì)照組(13.12 U)；其中ZDSJ-01菌株的活力最高，超出“小黑汀”85%，ZDSJ-08次之。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)通過(guò)最適生長(zhǎng)溫度和小試工廠化生產(chǎn)，只能提供灰樹花優(yōu)種的篩選依據(jù)，不能完全依靠其結(jié)果作為菌株篩選的最終標(biāo)準(zhǔn)。該試驗(yàn)階段獲得ZDSJ-01、ZDSJ-04和ZDSJ-08共3個(gè)野生優(yōu)種，均能在≥27 ℃時(shí)正常出菇；其中ZDSJ-08號(hào)可以在29 ℃時(shí)71 d完成2次出菇，且生物轉(zhuǎn)化率達(dá)88.6%；同時(shí)子實(shí)體性狀和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)較高，是難得的工廠化生產(chǎn)菌種。繼續(xù)考察了3個(gè)野生優(yōu)種的生長(zhǎng)勢(shì)、木聚糖酶活力和拮抗性，以定性或半定量的形式考察了菌種的親緣性關(guān)系和生物轉(zhuǎn)化能力,其中ZDSJ-08雖不是每項(xiàng)指標(biāo)均最佳，但綜合評(píng)比最佳。

綜上所述，灰樹花菌株ZDSJ-08可以作為夏季或較高溫地區(qū)工廠化生產(chǎn)菌種，能在71 d內(nèi)完成2次出菇，總生物轉(zhuǎn)化率達(dá)88.6%，與傳統(tǒng)主栽品種“小黑汀”相比，優(yōu)勢(shì)非常明顯；同時(shí)菌株生物穩(wěn)定性好，可進(jìn)一步研究其栽培工藝、環(huán)境控制參數(shù)等條件，保證高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。

[1] 潘輝,王瑞娟,李正鵬，等.工廠化栽培灰樹花菌株的篩選研究[J].北方園藝, 2011(1):188-191.

[2] 沈高潮,姚庭永,姚松濤,等.灰樹花“小黑汀”的特性及栽培要點(diǎn)[J].食藥用菌,2014,22(1):59-60.

[3] 陳秀娟.灰樹花工廠化周年栽培技術(shù)[J].中國(guó)園藝文摘,2012(6):141-142.

Study on Screening Resistance ofGrifolafrondosaProduction Strains at High Temperature

FENG Fang-xia1,2，F(xiàn)U Qing-wei2,3，WANG Feng-chun2et al

(1.Qianxi County Agriculture and Animal Husbandry Bureau,Qianxi,Hebei 064300;2.Qianxi Chestnut Industry Research Development Centre,Qianxi,Hebei 064300;3.Qianxi County Hong Quan Mushroom Cooperatives,Qianxi,Hebei 064300)

[Objective] The research aimed to select the suitable relatively high temperature environment to produce mushroom strains. [Method]Through the comparison of mycelium growth rate, growth vigor, antagonism of 11 wild strains ofGrifolafrondosa,and with cultivation period, fruitbody quality and early biological conversion rate as indicators,the industrial cultivation were studied.[Result]Under 24-32 ℃temperature battery cultivation mode,the mushroom cumulative biological matrix conversion rate of strain “ZDLM-08” was 88.6% for 71 days and two times.At the same time in color, flavor, leaf thickness, taste , fine flower shape and so excellent.[Conclusion]Strain “ZDLM-08” was suitable for high temperature factory cultivation ofGrifolafrondosa.

Grifolafrondosa; High temperature;Strains screening;Factory

馮芳俠(1982-)，女，陜西寶雞人，農(nóng)藝師，碩士，從事微生物發(fā)酵及食用菌研究。

2015-11-06

S 646

A

0517-6611(2015)35-223-02