正交試驗(yàn)法優(yōu)選濕清顆粒提取工藝

楊 弦， 謝 珊

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550002；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng) 550003)

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正交試驗(yàn)法優(yōu)選濕清顆粒提取工藝

楊 弦1， 謝 珊2

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550002；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng) 550003)

[目的]優(yōu)選濕清顆粒的最佳水提工藝。[方法]以干膏率和黃芩苷的含量為考察指標(biāo)，以加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素,采用L9(34)正交試驗(yàn)法優(yōu)選最佳水提工藝。[結(jié)果]優(yōu)選的最佳提取工藝為10倍量的水、煎煮提取2次、每次1 h。[結(jié)論]黃芩苷水提工藝條件穩(wěn)定、方法簡(jiǎn)便、實(shí)用可行，適用于工藝大生產(chǎn)，為濕清顆粒的制備奠定了理論基礎(chǔ)。

濕清顆粒劑；提取工藝；優(yōu)化；正交試驗(yàn)

濕清顆粒是治療濕疹的經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱涼血、解毒透疹、利濕的功效，處方由馬齒莧、黃芩、野菊花、紫荊皮、丹皮、苦參、龍骨、甘草等中藥材組成。臨床用于治療風(fēng)濕熱外邪入侵、氣血熱通行不暢、熱毒阻滯機(jī)體引起的濕疹[1]。本方中黃芩為君藥，黃芩苷為其治療濕疹的主要成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗菌、抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛等生物活性，廣泛用于細(xì)菌性感染、皮膚濕疹等疾病[2]。筆者以干膏率和黃芩苷的含量為考察指標(biāo)，采用水煎煮法提取，并以加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素,采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。高效液相色譜儀(日本島津LC-20AT型，SPD-20A型紫外可見(jiàn)檢測(cè)器)；BT125D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器[北京]有限公司)；SHB-III型循環(huán)水真空泵(北京市泰和格潤(rùn)儀器有限公司)。

1.1.2 主要試劑。黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110715-200514)；馬齒莧、黃芩、野菊花、紫荊皮、丹皮、苦參、龍骨、甘草(購(gòu)自四川眾仁藥業(yè)有限公司)；磷酸(高液)、水(純凈水)；甲醇、其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品的制備。精密稱(chēng)取在60 ℃減壓干燥4 h的黃芩苷對(duì)照品6.0 mg，加甲醇溶解并定容至10 ml，制成濃度為0.60 mg/ml的對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品的制備。按處方比例稱(chēng)取馬齒莧、黃芩、野菊花、紫荊皮、丹皮、苦參、龍骨、甘草等藥材，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案分別提取，制備干浸膏，取干浸膏適量，研細(xì)，精密稱(chēng)定0.3 g，加入70%乙醇40 ml，加熱回流3 h，放冷，濾過(guò)，濾液移入100 ml量瓶中，用乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)?，至刻度，搖勻。精密量取1.0 ml，至10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液[3-5]。

1.2.3 色譜條件。色譜柱為DiamonsilC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸(45∶55∶0.2)；流速1.0 ml/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500[6-7]。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 專(zhuān)屬性考察。分別吸取對(duì)照品溶液、黃芩藥材溶液、復(fù)方供試品溶液及復(fù)方陰性對(duì)照溶液各10 μl，按“1.2.3”色譜條件注入液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖，考察專(zhuān)屬性。

1.2.4.2 線(xiàn)性關(guān)系考察。取“1.2.1”項(xiàng)下0.60 mg/ml的黃芩苷對(duì)照品溶液，分別精密吸取0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4 ml置10 ml容量瓶中，稀釋至刻度，得一系列對(duì)照品溶液,濃度分別為0.012、0.024、0.048、0.060、0.072、0.084 mg/ml,分別進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度X(mg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并計(jì)算線(xiàn)性回歸方程。

1.2.4.3 精密度試驗(yàn)。按“1.2.2”制備供試品溶液，在“1.2.3”色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μl，測(cè)定黃芩苷的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.2”制備供試品溶液，在“1.2.3”色譜條件下于1、2、4、8、12 h分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μl，測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD值。

1.2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.2”制備6份供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件測(cè)定黃芩苷的平均含量和峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.4.6 加樣回收試驗(yàn)。精密量取“1.2.2”項(xiàng)下的復(fù)方供試品溶液0.5 ml(黃芩苷含量為0.463 mg/ml)共6份，置10 ml容量瓶中，按所取供試品黃芩苷含量的100%加入對(duì)照品溶液1 ml(0.232 mg/ml)，用甲醇定容至10 ml容量瓶，在“1.2.3”色譜條件下測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率和RSD值。

1.2.5 濕清顆粒的提取工藝。

1.2.5.1 正交試驗(yàn)。以水為溶劑對(duì)馬齒莧、黃芩、野菊花、紫荊皮、丹皮、苦參、龍骨、甘草等藥材進(jìn)行煎煮提取，采用綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，其中黃芩苷含量作為主指標(biāo)(權(quán)重系數(shù)0.7)，浸膏得率為次指標(biāo)(權(quán)重系數(shù)0.3)，即綜合評(píng)分=黃芩苷含量/黃芩苷最大含量×70%+出膏率/出膏率最大值×30%，并以加水量(A)、煎煮時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)為影響因素，采用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表1 水提取工藝因素水平表

1.2.5.2 干膏率的測(cè)定。按處方量稱(chēng)取馬齒莧、黃芩、野菊花、紫荊皮、丹皮、苦參、龍骨、甘草等藥材，共9份，按正交因素表中的各因素水平，采用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，水煎煮提取，濾過(guò)，合并濾液，濃縮，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，70 ℃干燥至恒重，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱(chēng)定重量，計(jì)算干膏得率。干膏得率=干膏量/藥材量×100%[8]。

1.2.5.3 樣品含量測(cè)定。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定黃芩苷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專(zhuān)屬性考察。按“1.2.4.1”條件下，記錄色譜圖。由圖1可知，黃芩苷對(duì)照品溶液在15～17 min有峰，黃芩藥材和復(fù)方在相應(yīng)時(shí)間均有峰與之對(duì)應(yīng)，而陰性對(duì)照溶液在15～17 min無(wú)峰，表明其他成分對(duì)黃芩苷的測(cè)定無(wú)干擾。

2.1.2 線(xiàn)性范圍考察。按“1.2.4.2”方法操作，峰面積分別為190 979、368 566、727 131、912 339、1 077 213、1 280 900，以進(jìn)樣濃度X(mg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得回歸方程為Y=2×107X+7 830.5(r=0.999 7)，表明黃芩苷在0.012～0.084 mg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.3”方法操作，計(jì)算RSD值為1.84%，表明精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，計(jì)算得出12 h內(nèi)峰面積值的RSD為0.82%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.5”方法操作，測(cè)得平均含量為1.12%，RSD值為1.98%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn)。按“1.2.4.6”方法操作，測(cè)得平均回收率為100.3%，RSD為2.8%。

2.2 濕清顆粒的提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果。按“1.2.5”方法操作，計(jì)算干膏得率、黃芩苷含量及綜合評(píng)分，由表2可見(jiàn)，各考察因素對(duì)浸出物重量和黃芩苷含量的影響大小順序?yàn)锽>C>A，最佳提取方案為A2B1C2，即10倍量的水，煎煮提取2次，每次1 h。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)。平行稱(chēng)取3份處方藥材，按照最佳工藝提取并制備相應(yīng)的供試品，測(cè)定干膏得率分別為24.46%、24.38%、24.30%，黃芩苷的含量分別為2.96、2.93、2.99 mg/g，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果均接近正交試驗(yàn)中的最大值，說(shuō)明優(yōu)選工藝穩(wěn)定。

3 結(jié)論與討論

濕清顆粒為復(fù)方制劑，溶劑的選擇是以藥材中有效成分的性質(zhì)與臨床常用提取方法相結(jié)合，根據(jù)各藥的有效成分及

表2 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

其溶解性，確定水為溶劑，煎煮提取，既能提高有效成分的溶出，又符合中藥復(fù)方傳統(tǒng)提取。徐丹陽(yáng)等[9]研究指出影響復(fù)方提取的主要因素是溶劑的用量、煎煮次數(shù)和煎煮時(shí)間等。該試驗(yàn)研究表明，最佳水提取工藝為10倍量的水、煎煮提取2次、每次1 h。按最佳提取工藝經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證得到黃芩苷的平均含量為2.96 mg/g，證明該黃芩苷水提工藝條件穩(wěn)定、方法簡(jiǎn)便、實(shí)用可行，適用于工藝大生產(chǎn)，為濕清顆粒的制備奠定了理論基礎(chǔ)。

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Extraction Process Optimization of Shiqing Granules by Orthogonal Test

YANG Xian,XIE Shan

(1.Guiyang University of Traditional Chinese Medicine,Guiyang,GuiZhou 550002;2.The Second Affiliated Hospital of Guiyang University of Traditional Chinese Medicine,Guiyang,GuiZhou 550002)

[Objective] The research aimed to optimize the water extraction process of Shiqing granules.[Method]With dry paste rate and the content of baicalin as examining index,the add water, extracting times and extracting time as factors,the best water extraction process was optimized by L9(34)orthogonal experimental method.[Result]The best extraction process was 10 times the amount of water, decoction extract 2 times, each time 1 h.[Conclusion]Baicalin water extraction processing conditions were stable, the method was simple, practical and feasible, and was suitable for the mass production of the process,which provides the theoretical foundation for the preparation of Shiqing granules.

Shiqing granules;Extraction process;Optimization;Orthogonal test

貴州省科技廳聯(lián)合基金課題“濕清顆粒制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究”。

楊弦(1988-)，女，土家族，貴州銅仁人，碩士研究生，研究方向：藥物新制劑與新劑型。

2015-11-16

S 567；R 283.6

A

0517-6611(2015)35-205-03