響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素發(fā)酵條件

林偉鈴,朱宏陽(yáng),饒雪娥,楊宏芳,李泳寧

(福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，福建福州 350101)

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響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素發(fā)酵條件

林偉鈴,朱宏陽(yáng)*,饒雪娥,楊宏芳,李泳寧

(福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，福建福州 350101)

[目的] 實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)細(xì)菌纖維素(Bacterialcellulose，BC)。 [方法]以解淀粉芽孢桿菌ZF-7(BacillusamyloliquefaciensZF-7)為菌源，通過單因素試驗(yàn)和中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面法(CCRD)對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)BC的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]利用單因素試驗(yàn)確定了最適碳源與氮源分別為D-葡萄糖和酵母膏，并確定了D-葡萄糖、酵母膏及無(wú)水乙醇添加量對(duì)BC產(chǎn)量(干重)的影響。響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖56.1 g/L、酵母提取物9.9 g/L、乙醇17.2 ml/L。在此條件下，測(cè)得BC產(chǎn)量7.88 g/L，比初始產(chǎn)量提高了35.4%。[結(jié)論] 研究可為解淀粉芽孢桿菌工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

細(xì)菌纖維素；解淀粉芽孢桿菌；響應(yīng)面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose,BC)是1種由葡萄糖分子以β-1,4糖苷鍵聚合而成的天然納米高分子材料，與植物纖維相比，細(xì)菌纖維素具有高結(jié)晶度，且其具有許多優(yōu)良特性，如：良好的生物相容性、生物可降解性、較強(qiáng)的持水能力和較高的力學(xué)性能等[1]。因此，細(xì)菌纖維素在制藥、食品、造紙和紡織等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[2]。

目前用于細(xì)菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌株有木醋桿菌(Acetobacterxylinum)[3]、漢遜氏葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterhansenii)[4]、木葡萄糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterxylinum)[5]或者解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[6](80-84)。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)細(xì)菌纖維素的合成過程、細(xì)菌纖維素的理化特性及發(fā)酵條件的優(yōu)化均做了大量的研究，并取得了一定的成果，為細(xì)菌纖維素的商業(yè)應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)[7-9]。筆者在前期研究工作中，從自然界篩選得到一株高產(chǎn)BC的B.amyloliquefaciensZF-7[6](80-84)。為進(jìn)一步提高其工業(yè)化應(yīng)用潛力，筆者以B.amyloliquefaciensZF-7為BC出發(fā)菌株，以BC產(chǎn)量(干重)為響應(yīng)值，采用單因素試驗(yàn)確定最適營(yíng)養(yǎng)因素及添加量，并應(yīng)用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化發(fā)酵條件，以確定較優(yōu)的發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)BC。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)ZF-7，存于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC6266。

1.1.2 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，牛肉膏5 g/L，檸檬酸5 g/L，Na2HPO4·12H2O 1 g/L，CaCO310 g/L，瓊脂粉20 g/L，121 ℃滅20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉膏5 g/L，檸檬酸1 g/L，Na2HPO4·12H2O 5 g/L，121 ℃滅20 min。種子培養(yǎng)條件為30 ℃，100 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，牛肉膏8 g/L，調(diào)節(jié)pH至6.5，121 ℃滅20 min。接種前于超凈臺(tái)內(nèi)向滅好菌的培養(yǎng)基內(nèi)添加用滅菌濾頭(0.22 μm)過濾的無(wú)水乙醇，終濃度為14 ml/L。發(fā)酵條件為30 ℃，靜置培養(yǎng)5 d。

1.2 單因素試驗(yàn)

1.2.1 碳源對(duì)產(chǎn)BC的影響。分別考察50 g/L的甘油、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖和菊粉水解物為碳源，其他成分與基本培養(yǎng)基相同，30 ℃，靜置培養(yǎng)5 d后檢測(cè)其濕重和干重，選出最佳碳源。并考察碳源濃度(20、30、40、50、60、80 g/L)對(duì)產(chǎn)BC的影響。

1.2.2 氮源對(duì)產(chǎn)BC的影響。選用最優(yōu)碳源及濃度，分別用8 g/L的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、 (NH4)2SO4、NH4Cl等做氮源，其他條件同上，測(cè)定BC濕重及干重，選出最佳氮源。并考察氮源濃度(5、8、10、15、20 g/L)對(duì)產(chǎn)BC的影響。

1.2.3 無(wú)水乙醇對(duì)產(chǎn)BC的影響。分別考察不同濃度的無(wú)水乙醇(8、10、12、14、16、18 g/L)對(duì)產(chǎn)BC的影響，其他條件同上，測(cè)定BC濕重及干重選出最佳濃度。

1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

由以上一系列試驗(yàn)結(jié)果可得出影響產(chǎn)BC的關(guān)鍵影響因子及其濃度，對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得出影響產(chǎn)BC的最佳培養(yǎng)基。

1.4 細(xì)胞濃度的檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取10 g濕膜并置于小燒杯中，加入活化好的纖維素酶液10 ml，浸泡一段時(shí)間然后濾除殘?jiān)?，于波長(zhǎng)660 nm測(cè)其吸光度。

1.5 細(xì)菌纖維素提取和處理方法

恒溫靜置培養(yǎng)5 d的細(xì)菌纖維素膜浮于表面，將膜取出后，用水多次沖洗，除去膜表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)，將膜浸泡于1% (質(zhì)量體積比)的NaOH溶液中，80 ℃恒溫30 min，至膜呈乳白色半透明，然后用0.5%(體積分?jǐn)?shù))乙酸溶液浸泡，再用蒸餾水沖洗至pH中性，瀝干表面水分，稱濕質(zhì)量，然后將纖維素膜于60 ℃烘箱烘至恒質(zhì)量，稱膜干質(zhì)量。纖維素的產(chǎn)量以1 L培養(yǎng)基中纖維素的質(zhì)量表示。

1.6 細(xì)菌纖維素產(chǎn)量和含水率的測(cè)定

將處理好的細(xì)菌纖維素凝膠于4 000 r/min離心30 min，所得膜定義為細(xì)菌纖維素濕質(zhì)量；將纖維素凝膠于80 ℃干燥至恒質(zhì)量，所得為細(xì)菌纖維素干質(zhì)量。用精密電子天平稱量細(xì)菌纖維素質(zhì)量：

細(xì)菌纖維素凝膠含水率=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)B.amyloliquefaciensZF-7產(chǎn)BC的影響

碳源是構(gòu)成菌體成分的重要元素，是細(xì)胞內(nèi)貯藏物質(zhì)及微生物生長(zhǎng)的主要能量來(lái)源，同時(shí)也是影響微生物分泌孢外產(chǎn)物的主要因素，碳源是合成BC的主要來(lái)源，同時(shí)還具有誘導(dǎo)或阻遏產(chǎn)物合成酶系的作用。試驗(yàn)分別考察了甘油、D-葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖和菊粉水解物為碳源，其他條件不變時(shí)對(duì)B.amyloliquefaciensZF-7的生長(zhǎng)及產(chǎn)BC的影響，結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，在菌體生長(zhǎng)方面，以甘油為碳源時(shí)，菌體生長(zhǎng)最好，D-果糖次之，菊粉水解物第三；在BC產(chǎn)量(干重)方面，以D-葡萄糖為碳源時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)到最高值5.82 g/L，其次是以甘油為碳源，BC產(chǎn)量為4.81 g/L。因此選用D-葡萄糖作為碳源，并考察其添加濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)BC的影響，結(jié)果如表2所示。

表1 不同碳源對(duì)Bacillus amyloliquefaciens的生長(zhǎng)及產(chǎn)BC的影響

從表2可以看出，D-葡萄糖濃度的提升在一定程度上有利于菌體的生長(zhǎng)及BC產(chǎn)量的提高。當(dāng)D-葡萄糖濃度升至40 g/L時(shí)菌體生長(zhǎng)達(dá)到最大值。當(dāng)D-葡萄糖濃度進(jìn)一步提升至50 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)呈小幅下降趨勢(shì)，而此時(shí)BC產(chǎn)量達(dá)到最高值5.92 g/L。當(dāng)D-葡萄糖濃度為60 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)繼續(xù)下降，BC產(chǎn)量也呈下降趨勢(shì)。當(dāng)D-葡萄糖濃度為80 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)被抑制，BC產(chǎn)量低于1 g/L，可能是由于高濃度的D-葡萄糖會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)而影響B(tài)C的合成。因此，選擇50 g/L的D-葡萄糖為最適碳源濃度。

2.2 氮源對(duì)B.amyloliquefaciensZF-7產(chǎn)BC的影響

氮是構(gòu)成微生物細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的重要組成成分，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成有著重要的影響。試驗(yàn)考察了酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硫酸銨、氯化銨等對(duì)B.amyloliquefaciensZF-7的生長(zhǎng)及產(chǎn)BC的影響，結(jié)果如表3所示。從表3中可以看出，以玉米漿為氮源時(shí)，菌體生長(zhǎng)最好，以酵母膏為氮源時(shí)次之，牛肉膏為氮源時(shí)菌體生長(zhǎng)居第三。對(duì)于BC的產(chǎn)量方面，則以酵母膏為氮源時(shí)最高，達(dá)6.81 g/L，而添加其他氮源時(shí)，BC產(chǎn)量均低于以酵母膏為氮源時(shí)的產(chǎn)量。此外，當(dāng)添加無(wú)機(jī)氮源時(shí)，菌體生長(zhǎng)受到抑制，OD660低于0.50，從而影響B(tài)C的合成。因此選擇酵母膏為氮源，并考察其濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)BC的影響，結(jié)果如表4所示。

表2 葡萄糖添加量對(duì)B.amyloliquefaciens的生長(zhǎng)及產(chǎn)BC的影響

從表4中可以看出，隨著酵母膏添加量的提升，菌體生長(zhǎng)也隨之上升，而BC產(chǎn)量則先升后降，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母膏的添加量為10 g/L時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)到最高值7.36 g/L，這可能是由于大部分碳源都被用于菌體生長(zhǎng)而影響了產(chǎn)物的合成。因此，選擇10 g/L的酵母膏為最適氮源濃度。

2.3 乙醇添加量對(duì)B.amyloliquefaciensZF-7產(chǎn)BC的影響

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乙醇能夠刺激BC的生產(chǎn)并顯著提高BC的產(chǎn)量[10]。因此，試驗(yàn)考察了乙醇添加量對(duì)B.amyloliquefaciensZF-7的生長(zhǎng)及產(chǎn)BC的影響。試驗(yàn)結(jié)果(表5)表明，隨著乙醇濃度的增大，菌體生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，這可能是乙醇濃度的上升抑制了菌體的生長(zhǎng)。BC的產(chǎn)量在一定程度上隨著乙醇添加量的增加呈上升趨勢(shì)。當(dāng)乙醇添加量為16 ml/L時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)到最大值7.64 g/L。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成

由以上一系列單因素條件試驗(yàn)結(jié)果可知，影響產(chǎn)BC的顯著影響因子為D-葡萄糖、酵母膏及無(wú)水乙醇，以此3個(gè)因子為自變量，以ZF-7菌的菌體生長(zhǎng)情況和BC產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)中心復(fù)合試驗(yàn)，各因子的試驗(yàn)水平及編碼值見表6，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7。

表5 乙醇添加量對(duì)B.amyloliquefaciens ZF-7的生長(zhǎng)及產(chǎn)BC的影響

表6 中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼

表7 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

從該方程的分析可知，R2=0.950 5，這表明模型可以用來(lái)解釋試驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，為了確定各因素的最佳值，對(duì)擬合方程求極值得：X1=56.1，X2=9.9，X3=17.2，代入回歸方程得最大值Y=7.83 g/L。各因素相互作用圖見圖1。

比較回歸方程的解，各因素的取值基本相近，為試驗(yàn)操作的方便，確定D-葡萄糖56.00 g/L，酵母膏10 g/L，無(wú)水乙醇17 ml/L，在該模型處做3次試驗(yàn)驗(yàn)證，得出BC產(chǎn)量為7.88 g/L。此結(jié)果與預(yù)測(cè)值相符，證實(shí)了模型有效性及存在著極大值點(diǎn)。預(yù)測(cè)培養(yǎng)基提高了BC產(chǎn)量，提高幅度為35.4%，因此具有指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

該研究通過對(duì)B.amyloliquefaciensZF-7產(chǎn)BC單因素試驗(yàn)，得出最適碳、氮源分別為D-葡萄糖與酵母膏，各因素的添加量為：D-葡萄糖50 g/L、酵母膏10 g/L、無(wú)水乙醇16 ml/L。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用CCRD響應(yīng)面軟件優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，得到最佳條件為：D-葡萄糖56.1 g/L、酵母膏9.9 g/L、無(wú)水乙醇17.2 ml/L，在此條件下，預(yù)測(cè)BC產(chǎn)量為7.83 g/L。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，BC產(chǎn)量為7.88 g/L，與初始產(chǎn)量相比提高了35.4%。B.amyloliquefaciensZF-7是一株從自然環(huán)境中篩選得到的野生菌種，即使發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，但是仍不適合應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。后續(xù)研究將對(duì)該菌種進(jìn)行誘變育種，以期篩選到適合工業(yè)化生產(chǎn)的誘變株。

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Optimization of Fermentation Conditions for Bacterial Cellulose Producing byBacillusamyloliquefaciensUsing Response Surface Methodology

LIN Wei-ling,ZHU Hong-yang*,RAO Xue-e et al

(Department of Pharmacy,Fujian Health College,Fuzhou,Fujian 350101)

[Objective] To realize high efficient production of bacterial cellulose(BC).[Method] The production of BC byBacillusamyloliquefaciensZF-7 was studied and the fermentation conditions were optimized.D-glucose and yeast extract were selected as the optimum carbon source and nitrogen source respectively.The effect of D-glucose,yeast extract and ethanol concentration on BC production was investigated by single factor methods.[Result] Based on the result of single factor experiments,the optimum conditions of fermentation were investigated by central composite design and response surface methodology.The results showed that the best conditions for BC fermentation were shown as follow:56.1 g/L of D-glucose,9.9 g/L of yeast extract and 17.2 ml/L ethanol.Under these conditions,the BC yield ofB.amyloliquefaciensZF-7 reached 7.88 g/L,which was increased by 35.4%as compared to the initial yield before the optimization.[Conclusion] The study can provide reference for industrial application ofBacillusamyloliquefaciens.

Bacterial cellulose;Bacillusamyloliquefaciens; Response surface analysis; Culture medium optimization

福建省教育廳A類科技項(xiàng)目(JA13414)；福建省教育廳B類科技項(xiàng)目(JB14205)。

林偉鈴(1984- )，女，福建福州人，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事微生物遺傳育種研究。*通訊作者，講師，博士，從事微生物育種與發(fā)酵工藝研究。

2015-11-06

S 182

A

0517-6611(2015)35-142-03