乳酸鏈球菌素分離純化研究進(jìn)展

左愛(ài)輝 孫遠(yuǎn)功 劉鑫峰

（洛陽(yáng)奇泓生物科技有限公司，河南洛陽(yáng) 471041）

乳酸鏈球菌素分離純化研究進(jìn)展

左愛(ài)輝 孫遠(yuǎn)功 劉鑫峰

（洛陽(yáng)奇泓生物科技有限公司，河南洛陽(yáng) 471041）

當(dāng)今市場(chǎng)上的乳酸鏈球菌素純度較低，限制了其應(yīng)用前景。Nisin作為新型的高效、無(wú)毒、安全的天然食品防腐劑，進(jìn)入人體后分解為人體可吸收的氨基酸，且不影響腸道菌群的正?；顒?dòng)。此外，Nisin在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域也有很大的應(yīng)用前景。通過(guò)對(duì)Nisin常用分離純化技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)的分析，并總結(jié)前人在Nisin分離純化方面的研究，為后續(xù)研究者提供一些理論參考。

乳酸鏈球菌素；鹽析法；層析技術(shù)；HPLC

乳酸鏈球菌素（NinhibiforySubstance，Nisin）也叫乳酸鏈球菌肽或尼生素，是從鏈球菌屬的乳酸鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取的一類(lèi)多肽化合物。Nisin作為新型的高效、無(wú)毒、安全的天然食品防腐劑，進(jìn)入人體后被機(jī)體蛋白酶消化分解為氨基酸，被機(jī)體吸收利用，并且不影響腸道內(nèi)正常菌群的生命活動(dòng)，是當(dāng)今食品行業(yè)中保鮮防腐，延長(zhǎng)貨架期的絕對(duì)良品。除此之外，Nisin在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域也有很大的應(yīng)用前景，高純度的Nisin對(duì)治療母牛乳腺炎有很好的療效［1］。然而，當(dāng)今市售的Nisin純度較低，且含有較多的雜蛋白，進(jìn)入機(jī)體后會(huì)引起一些不良反應(yīng)，影響了其在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用和推廣。因此，如何獲取高純度的Nisin是未來(lái)研究者應(yīng)著重努力的重點(diǎn)。

本文就當(dāng)前科研和生產(chǎn)領(lǐng)域主要用到的分離純化技術(shù)做簡(jiǎn)要陳述，并對(duì)其在乳酸鏈球菌素提取領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行分析，以期為今后獲取高純度的Nisin提出一些理論參考。

1 Nisin分離純化技術(shù)

1.1 常用分離方法

目前乳酸鏈球菌素的常用分離純化方法主要有：有機(jī)溶劑法、鹽析法、菌體吸附法、樹(shù)脂吸附法、泡沫分離法等。

1.1.1 有機(jī)溶劑法。有機(jī)溶劑法也稱為正丙醇法，其利用有機(jī)溶劑沉淀Nisin，利用KH2PO4等進(jìn)行鹽析，反復(fù)沉淀后溶解（主要溶劑為正丙醇）得到乳酸鏈球菌素的粗品。該方法的缺點(diǎn)是不能充分沉淀，而且有機(jī)溶劑殘余對(duì)Nisin應(yīng)用有很大影響。魯吉珂等［2］在試驗(yàn)中以有機(jī)溶劑三氯甲烷和正丁醇配合使用的方法，從發(fā)酵濃縮液中提取出乳酸鏈球菌素，正丁醇和三氯甲烷體積比1:1組成的復(fù)合溶劑，提取效果優(yōu)于單一的有機(jī)溶劑。

1.1.2 鹽析法。蛋白質(zhì)分子在低鹽濃度下的溶解度隨著鹽溶液濃度升高而增加，稱為鹽溶；當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又因溶解度下降而先后析出，稱為鹽析。乳酸鏈球菌素采用鹽析法提取的過(guò)程中，用硫酸銨沉淀得到Nisin粗品，回收率相對(duì)較高，且所得Nisin產(chǎn)品活性損失較少。該方法缺點(diǎn)也非常明顯，在鹽析過(guò)程中，發(fā)酵液中的其他蛋白類(lèi)物質(zhì)也隨之沉淀，導(dǎo)致Nisin成品純度偏低。同時(shí)廢水中的硫酸銨對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，增加環(huán)保壓力。

1.1.3 菌體吸附法。菌體吸附法通過(guò)調(diào)節(jié)pH使乳酸鏈球菌選擇性的吸附、釋放乳酸鏈球菌素。葉嗣穎等［3］通過(guò)pH吸附法，利用乳酸鏈球菌亞種研究了NisinZ分子在不同pH環(huán)境下的吸附作用及其分離純化效率，并采用SDS-PAGE和RP-HPLC進(jìn)行純度鑒定，證實(shí)用此技術(shù)分離NisinZ具有高效、高純度、操作簡(jiǎn)便等良好特性，但此法也存在著損失率偏高的問(wèn)題。

1.1.4 樹(shù)脂吸附法。樹(shù)脂吸附法原理是乳酸鏈球菌素在一定條件下可以與某些樹(shù)脂發(fā)生特異性吸附，改變條件后吸附減弱，乳酸鏈球菌素可被洗脫下來(lái)。大孔吸附樹(shù)脂是一類(lèi)具有大孔結(jié)構(gòu)的非離子型高分子化合物，具有吸附和篩選功能，且容易再生，在分離純化蛋白質(zhì)時(shí)具有條件溫和、設(shè)備簡(jiǎn)單和操作方便的特點(diǎn)［4］。王暉等［5］采用大孔吸附樹(shù)脂分離發(fā)酵液中的乳鏈菌肽，確定了兩種樹(shù)脂D3520、D4020對(duì)乳鏈菌肽靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附及靜態(tài)解吸的最優(yōu)化操作條件。與其他分離純化方法相比，用大孔樹(shù)脂分離純化的方法簡(jiǎn)便易行、分離純度高、安全無(wú)毒害，是一種有效地分離手段。

1.1.5 泡沫分離法。泡沫分離法主要采用鼓泡塔間歇分離，然后用無(wú)機(jī)鹽鹽析、噴霧干燥，制成食品級(jí)乳酸鏈球菌素粉末。生產(chǎn)中采用泡沫分離法受多種因素的影響，包括溶液pH值、表面活性劑性質(zhì)、泡沫的性質(zhì)、排沫方式、攪拌等。

1.2 層析色譜技術(shù)

層析色譜技術(shù)根據(jù)分離物質(zhì)和固定相間作用力的不同，可分為凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、反相層析、親和層析、親核膜分離技術(shù)、高效液相色譜法等諸多方法。

1.2.1 凝膠過(guò)濾層析。凝膠過(guò)濾層析根據(jù)被分離物質(zhì)分子量差異而進(jìn)行分離。當(dāng)含有不同大小的混合物樣品加入到凝膠色譜柱中，隨著洗脫液的流動(dòng)，分子質(zhì)量最大的物質(zhì)因不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，分子量最小的物質(zhì)因能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出色譜柱，從而使混合物樣品中不同分子量的物質(zhì)得以分離。該方法設(shè)備要求簡(jiǎn)單，操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果，因此被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程以及醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［6］。吳紅艷等［7］采用凝膠層析對(duì)乳酸菌粗提液進(jìn)行分離、純化，得到乳酸菌肽純化樣品，并對(duì)其含量、純度及抑菌效果等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，得出純化時(shí)間在14～18h所收集的樣品含量最高、純度最高、抑菌效果最好。從而獲得了重要的乳酸菌肽研究資料，為今后更進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。

1.2.2 離子交換層析。離子交換層析以離子交換樹(shù)脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動(dòng)相，使不同溶質(zhì)按照其離子交換親和力的不同而得到分離的方法。Nisin由34個(gè)氨基酸組成，同時(shí)具有疏水性和親水性結(jié)構(gòu)，其在不同的pH溶液中帶有不同的電荷，因此可以通過(guò)離子交換層析法進(jìn)行分離純化。

1.2.3 反相層析。反相層析是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性（疏水性）的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離純化的層析方法。其固定相表面完全被非極性集團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疏水性。反相層析介質(zhì)性能穩(wěn)定，分離效率高，主要應(yīng)用于分子量5000以下的小分子物質(zhì)分析。

1.2.4 親和層析。親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相來(lái)吸附目標(biāo)產(chǎn)物，使其得到分離純化的液相層析法。親和層析法只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，達(dá)到千倍以上的純化效果并保持較高的生物學(xué)活性。親和層析法步驟簡(jiǎn)單，純化時(shí)間短，非常有利于不穩(wěn)定蛋白的純化。目前親和層析技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)的研究和制備領(lǐng)域，是分離純化以及分析生物大分子（尤其是蛋白質(zhì)）的有力工具［8］。

1.2.5 親和膜分離。親和膜分離是將親和分離技術(shù)和膜分離技術(shù)結(jié)合，將親和配基結(jié)合在分離膜上，利用膜作為基質(zhì)，對(duì)膜進(jìn)行改性，再按照吸附、清洗、洗脫和再生的過(guò)程，對(duì)生物產(chǎn)品進(jìn)行分離純化。親和膜分離具有親和分離技術(shù)的高選擇性，同時(shí)親和配基固定在膜載體上，傳質(zhì)阻力大大減小，便于連續(xù)、自動(dòng)化操作，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。在上述親和層析介質(zhì)制備的基礎(chǔ)上，采用相同的親和配基，選擇合適的親和膜載體，對(duì)載體活化及膜分離過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化和放大，從而建立工業(yè)化規(guī)模層析裝置。

1.2.6 高效液相色譜法。

高效液相色譜法（High PerformanceLiquidChromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）是一種高效快速分離化合物的方法，由于其靈敏度高，重復(fù)性好，分析速度快，應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，近年來(lái)在生物大分子的分離和純化方面占據(jù)了極其重要的地位。此外高效液相色譜還具有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)。它能有效地分離各種多肽混合物，特別適用于分子質(zhì)量不大的蛋白質(zhì)及多肽物質(zhì)的分離、純化和鑒定，在蛋白質(zhì)及多肽研究中得到了廣泛的應(yīng)用。其中反相高效液相色譜（RPLC）被廣泛應(yīng)用于分子質(zhì)量不大的蛋白質(zhì)分離、純化和鑒定上［8］。

1.3 凝膠電泳

凝膠電泳主要包括SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和雙向電泳。這兩種研究方法主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量大小的定量研究。

1.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑（過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺）作用下，聚合交聯(lián)成網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS后，其掩蓋了蛋白質(zhì)分子間電荷的差異，僅僅由蛋白質(zhì)分子量大小決定其在凝膠中的遷移率。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確性，是目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)蛋白質(zhì)分離樣品純度常用的分析技術(shù)。

1.3.2 雙向電泳。雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)，主要由等電聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳復(fù)合而成，第一向進(jìn)行等電點(diǎn)聚焦，蛋白質(zhì)分子沿pH梯度進(jìn)行分離，到達(dá)各自的等電點(diǎn)；隨后，再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。該技術(shù)能夠把混合液中每個(gè)不同的蛋白質(zhì)分子分離開(kāi)來(lái)，由于操作復(fù)雜，價(jià)格昂貴，目前只適用于實(shí)驗(yàn)室研究。

2 層析技術(shù)和HPLC等在Nisin分離純化中的運(yùn)用

通常情況下，如果試驗(yàn)中需要相當(dāng)純度的抗菌肽，需要綜合運(yùn)用多種方法才能得到所需的產(chǎn)物。

李增利［9］研究認(rèn)為，Nisin的電荷性和疏水性使其易從含有高濃度多肽的發(fā)酵液中分離出來(lái)。實(shí)驗(yàn)室純化Nisin的程序一般包括硫酸銨鹽析、離子交換色譜、疏水作用色譜和反相高效液相色譜多種純化步驟；也可用等電聚焦電泳替代色譜分離法純化Nisin，或采用免疫親和色譜分離法一步純化Nisin。盡管這些方法均具有很好的效果，但并不適合Nisin的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。

目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一些基于吸附-解析或者相分配原理大規(guī)?；厥蘸图兓疦isin的有效方法：如調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.0～6.5時(shí)，使Nisin吸附于產(chǎn)生菌細(xì)胞上，然后進(jìn)行細(xì)胞分離，并在pH2.0和0.1mol/LNaCl條件下進(jìn)行解吸而回收分離Nisin；不過(guò)當(dāng)發(fā)酵液中Nisin濃度過(guò)高時(shí)，將會(huì)超過(guò)菌體細(xì)胞吸附Nisin的能力，影響Nisin的回收率。

杜琨等［10］采用分離、凝膠層析、抑菌實(shí)驗(yàn)、高效液相色譜法，來(lái)純化從高原酸奶中提取的乳酸鏈球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素，得到了純度較高的乳酸鏈球菌素。

盛博文［11］在研究中聯(lián)合使用10k超濾管離心、SephadexG-25凝膠過(guò)濾、離子交換層析、制備型以及分析型反相高效液相色譜等方法，對(duì)乳酸鏈球菌發(fā)酵液進(jìn)行分步分離和純化，得到了純品NisinP。其研究方法為生產(chǎn)Nisin提供很高的參考價(jià)值。

3 展望

隨著人們生活水平的提高和綠色保健食品觀念的增強(qiáng)，在食品中添加純天然防腐劑的研究和應(yīng)用越來(lái)越受到人們的重視和關(guān)注。Nisin作為一種高效、無(wú)毒的純天然食品添加劑完全符合未來(lái)食品防腐劑的要求［12］。生產(chǎn)中如何獲得高純度的Nisin產(chǎn)品，使其在食品和醫(yī)療領(lǐng)域能夠廣泛應(yīng)用，是我們研究者面臨的主要難題。

層析技術(shù)和凝膠電泳作為現(xiàn)代分離技術(shù)的核心技術(shù)，在單一技術(shù)不能解決問(wèn)題的情況下，如何通過(guò)兩種功能互補(bǔ)的技術(shù)相結(jié)合而達(dá)到我們預(yù)期目的是我們亟待解決的問(wèn)題。本文通過(guò)對(duì)Nisin分離純化技術(shù)的總結(jié)，整理前人的研究成果，能夠?yàn)楹罄m(xù)研究者提供一些理論參考。

［1］吳俊強(qiáng)，曹立亭，胡松華.乳酸鏈球菌素治療奶牛乳房炎效果觀察［C］.獸醫(yī)臨床學(xué)術(shù)年會(huì)，2008：397-400.

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The Research Progress of Separation and Purification of Nisin

Zuo Aihui Sun Yuangong Liu Xinfeng
(Luoyang ChiHon Biotechnology Co.，Ltd，Luoyang Henan，471041)

The low purity of Nisin on the present market limits its application prospects. Nisin, as a new highlyefficient, non-toxic, safe natural food preservative, decomposes into the amino acids that can be absorbed in humanbody, and does not affect the normal activities of the intestinal flora. In addition, Nisin also has great prospects in thehealth field. We provide some theoretical reference for subsequent researchers in the article through the analysis ofthe advantages and disadvantages of the commonly used separation and purification technology of Nisin andsummarizing previous studies on separation and purification of Nisin.

Nisin；salting out method；chromatographic technique；HPLC

Q936

：A

：1003-5168（2015）03-0134-3

2015-2-19

左愛(ài)輝（1986-），男，碩士研究生，研究方向：微生物工藝研究。