白僵菌在油茶苗圃地的宿存變化、介質(zhì)影響及毒力分析

郭宗芳，謝再成，廖明輝

（贛州市林業(yè)科學(xué)研究所，江西贛州 341000）

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一種昆蟲病原真菌，廣泛應(yīng)用于林業(yè)害蟲的防治[1]。同時(shí)在地下害蟲防治上也能達(dá)到很好的防治效果。白僵菌不但能寄生昆蟲，而且能在生態(tài)系統(tǒng)中寄主昆蟲缺乏的時(shí)候，在不同的環(huán)境中營腐生生活[2-3]。因此，研究白僵菌在土壤中的宿存情況、使用中的不同混配介質(zhì)對(duì)白僵菌宿存影響比較，為白僵菌菌肥制劑的開發(fā)應(yīng)用提供一些幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

贛州市林科所油茶苗圃，試驗(yàn)區(qū)地勢(shì)平整，土壤偏酸性，肥水管理一致。

1.2 材料

菌株來源：贛州市林科所儲(chǔ)存的馬尾松毛蟲菌株；家蠶僵蟲分離菌株；PDA 培養(yǎng)基分離純化培養(yǎng)。

白僵菌孢子粉來源：贛州市林業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)，含孢量為100 億/g。藥用小型粉碎機(jī)粉碎。

白僵菌菌肥：應(yīng)用甜葉菊渣發(fā)酵物、玉米粉、麥麩和谷殼等生產(chǎn)培養(yǎng)白僵菌，含孢量90 億/g。藥用小型粉碎機(jī)粉碎。

SDAY 選擇性培養(yǎng)基：購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 土壤宿存變化動(dòng)態(tài)

1.3.1 SDAY 選擇性培養(yǎng)基的制作。稱取成品SDAY 選擇性培養(yǎng)基80.0g，加熱溶解于1000mL 蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。

1.3.2 試驗(yàn)小區(qū)設(shè)置。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理（見表1）。試驗(yàn)地選在贛州市林業(yè)科學(xué)研究所苗圃地（肥水管理一致）的作物間隙選取5 塊50cm×50cm 的小區(qū)，相鄰小區(qū)至少間隔1m。取出方格內(nèi)2cm 厚表層土，然后均勻播撒各種試劑；再把表層土平整鋪回對(duì)應(yīng)區(qū)內(nèi)，每小區(qū)1個(gè)處理。藥后1個(gè)月開始取樣，間隔1 或2月，即藥后30d（4月）、60d、90d、120d、150d、180d、210d、270d、330d各1 次。

表1 劑型配制

1.3.3 取樣方法。用圓柱形取樣器（直徑4.5mm），在5種不同的試劑區(qū)內(nèi)用五點(diǎn)式取樣法采集土樣，取樣厚度達(dá)15cm。

1.3.4 白僵菌成菌落數(shù)（CFU）的測(cè)定。（按王濱[4]的方法，并加以改進(jìn)），用圓柱形取樣器（直徑4.5mm）取出土樣，分別置入裝有100mL 0.05%滅菌吐溫-80 溶液的250mL 三角瓶中，于快速震蕩器上震蕩30min，使其充分混勻。每個(gè)樣品梯度稀釋成10（-3）、10（-4）、10（-5）、10（-6）和10（-7）濃度，每次稀釋后均于快速震蕩器上震蕩30min，充分震蕩均勻。用微量移液管精確移取各濃度土壤懸液0.3mL 于制好的選擇性培養(yǎng)基上鋪成平板，每個(gè)濃度重復(fù)3 次。將平板置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)10d，觀察、記錄各培養(yǎng)皿中白僵菌成菌落數(shù)。以適宜濃度的白僵菌成菌落數(shù)作為測(cè)定依據(jù)（CFU值在10～100 間為宜）

1.4 宿存分離株對(duì)家蠶毒力測(cè)定

供試菌株：從上述A、B、C 小區(qū)的宿存實(shí)驗(yàn)成菌落數(shù)（CFU）的測(cè)定中選取培養(yǎng)基內(nèi)較大的菌落進(jìn)行對(duì)家蠶毒力試驗(yàn)。

1.4.1 孢懸液制備。定期（即藥后60d、120d、210d、270d各1 次）從宿存試驗(yàn)樣地（A、B、C）中分離得到不同的分離株，取純化好的分離株，用0.05%的滅菌吐溫-80溶液稀釋，充分震蕩后接種至SDAY 平板培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d。優(yōu)選菌落直徑較大的分離株中提取一定量的孢子，用0.05%吐溫-80 無菌水，梯度配成1 億個(gè)/mL 濃度的孢懸液。

1.4.2 對(duì)家蠶毒力測(cè)定（浸蟲法）。取20mL 孢懸液，挑選大小相近的健康家蠶20 頭浸入孢懸液5s，取出后用濾紙吸干蟲體上多余的液體，放入15cm 培養(yǎng)皿中，用鮮桑葉喂養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度25℃，濕度90%。每處理3個(gè)重復(fù)。飼養(yǎng)14d，每天觀測(cè)家蠶生長狀況，更換新桑葉，將死亡蟲體移出，前3 天死蟲不計(jì)，第4d 開始統(tǒng)計(jì)死亡率，連續(xù)調(diào)查15d。死亡蟲體保濕培養(yǎng)7d，檢查蟲體上是否有菌絲和分生孢子長出，統(tǒng)計(jì)僵蟲數(shù)。計(jì)算死亡率、侵染率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Duncan 氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 白僵菌1年中宿存數(shù)量動(dòng)態(tài)變化分析

白僵菌在土壤中的宿存受土壤中的生物和非生物的因素影響，其數(shù)量動(dòng)態(tài)受土壤濕度、環(huán)境溫度和土壤微生物的直接影響，尤其紫外線對(duì)表層土壤中的白僵菌殺傷作用，導(dǎo)致孢子的大量死亡[5-7]。以1年為周期，隔1月或2月取樣調(diào)查白僵菌種群數(shù)量。由圖1 所示，起始2月內(nèi)活性孢子量降低較快，降低速率達(dá)65%以上。5～6月隨雨水增多，為白僵菌的腐生生長提供了適宜條件，活性孢子降低速率較小；7～8月高溫干旱降低速率會(huì)加大；而10～12月 隨著土壤中落葉等的腐熟，土壤中有機(jī)質(zhì)增加了，從而提高了孢子萌發(fā)養(yǎng)分，白僵菌種群宿存有上升的趨勢(shì)。

受紫外線影響，采取表面撒施的小區(qū)活性孢子量降低較快。試驗(yàn)E 和試驗(yàn)C 相比，在1個(gè)月后調(diào)查測(cè)定顯示，試驗(yàn)E 種群數(shù)量與初始成菌落數(shù)相比降低了88%左右，而試驗(yàn)C 降低了63%。在實(shí)際使用中不建議采用土表撒施法，而建議采用覆土法。

不同的混合介質(zhì)影響白僵菌宿存。試驗(yàn)劑型（A、B、C）3 種介質(zhì)中，有機(jī)質(zhì)有利于白僵菌在土壤中生長，而草木灰會(huì)抑制白僵菌生長。如圖1 所示，應(yīng)用腐熟的有機(jī)質(zhì)生產(chǎn)的白僵菌菌肥其在土壤中的宿存比孢子粉與土壤混配表現(xiàn)更好。

從宿存變化中可看出試驗(yàn)C 與試驗(yàn)D 在土壤中宿存變化相似，但高濃度的試驗(yàn)D 在試驗(yàn)后的第1個(gè)月內(nèi)降解迅速，可能是土壤中提供不了足夠養(yǎng)分供高濃度的白僵菌生長,導(dǎo)致白僵菌大量死亡。這也說明C措施是較為經(jīng)濟(jì)適應(yīng)的使用方案。

2.2 宿存菌株毒力分析

從圖2 可看出，白僵菌在土壤中的宿存菌株其毒力隨著宿存時(shí)間的延長呈下降趨勢(shì)。而宿存菌株的致病力和孢子活性受環(huán)境溫度、土壤溫度、土壤濕度影響較大，高溫干旱季節(jié)（7、8、9月）土壤中白僵菌宿存量及致病性均下降明顯。宿存菌株毒力與僵蟲率呈正相關(guān)，毒力越好其僵蟲率也越高。

圖1 白僵菌1年中宿存數(shù)量動(dòng)態(tài)變化

圖2 不同宿存菌株（A、B、C）在一年四季中的致病力對(duì)比

圖3 不同宿存菌株（A、B、C）在一年四季的僵蟲率對(duì)比

圖2、圖3 中顯示，宿存分離株A 和C 毒力相近，其毒力和孢子活性保存較良好；宿存分離株B 差異顯著，可能是由于試驗(yàn)B 中草木灰pH 值呈堿性，明顯地抑制白僵菌生長。

3 結(jié)論

試驗(yàn)證明，白僵菌在土壤中能保持較穩(wěn)定的毒力，在富含有機(jī)質(zhì)的土壤中能保持一定的再生產(chǎn)孢能力，在土壤中宿存1年后依然保持在103 水平上，本試驗(yàn)也從混合介質(zhì)與白僵菌的相容性做了初步比較分析，有機(jī)質(zhì)有利于白僵菌生長。白僵菌這種在土壤中較強(qiáng)的宿存能力，較穩(wěn)定的毒力能達(dá)到其它化學(xué)農(nóng)藥無法保證的持續(xù)控制效果。在肥料應(yīng)用層面，白僵菌作為菌肥使用或菌肥劑型開發(fā)應(yīng)用，也具有一般有機(jī)肥無法具備持續(xù)殺蟲效果，為白僵菌在菌肥方向的應(yīng)用拓展取得了初步依據(jù)。

目前白僵菌在地下害蟲防治上較多地應(yīng)用于花生蠐螬防治上，其它的害蟲防治應(yīng)用較少。象白僵菌這種發(fā)現(xiàn)較早，但劑型研發(fā)嚴(yán)重落后的生物殺蟲劑，還有待我們科研工作者提高認(rèn)識(shí)，加強(qiáng)科技研發(fā)水平，加大宣傳推廣力度，使白僵菌產(chǎn)品更好地服務(wù)于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)。