動物毛色候選基因TYRP1的研究進展

李麗莎，李祥龍

(1 河北農(nóng)業(yè)大學，河北 保定，071000；2 河北科技師范學院)

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動物毛色候選基因TYRP1的研究進展

李麗莎1，李祥龍2*

(1 河北農(nóng)業(yè)大學，河北 保定，071000；2 河北科技師范學院)

就TYRP1基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、多態(tài)性及在不同組織中的差異表達與毛色形成的關(guān)系進行了概述，并對今后在TYRP1基因方面的研究進行了展望。

TYRP1基因；動物毛色；研究進展

動物毛色是毛皮動物絨、毛、羔皮及裘皮的重要質(zhì)量性狀[1]，同時作為識別和鑒定品種的重要標志，在動物育種尤其是在分子水平上已經(jīng)成為一個重要的育種性狀[2]。脊椎動物表層結(jié)構(gòu)中最主要的色素來源是黑色素。在哺乳動物體內(nèi)，黑色素主要分為2大類，一類是不含硫原子且難溶于堿性溶液的真黑素，形成黑色和褐色；另一類是含硫原子且易溶于堿性溶液的褐黑素，形成紅色和黃色[3]。動物毛色表型由真黑素和褐黑素在體內(nèi)的分布和比例來決定[4,5]。動物毛色是使動物皮膚免受紫外線輻射危害的天然保護層[6]，一些動物還能借助自身的表皮色素來偽裝或炫耀自己[7]，從而進行躲避捕食、社會交往或性別選擇等活動[8]。動物體內(nèi)許多基因都能影響其毛色的形成，且各基因間存在互作效應(yīng)，導致動物毛色形成的原因極為復(fù)雜[9]。酪氨酸相關(guān)蛋白酶1(tyrosinase-related protein 1，TYRP1)基因作為第一個成功克隆的色素基因，該基因在真黑素形成中發(fā)揮的關(guān)鍵作用已引起人們重視[10,11]。筆者就TYRP1基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、多態(tài)性及在不同組織中的差異表達與毛色形成的關(guān)系進行簡要概述，以期為進一步研究該基因在黑色素形成中的機理提供依據(jù)。

1 TYRP1基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)

TYRP1基因編碼蛋白與酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)同源性高達40%[12]，和酪氨酸相關(guān)蛋白2(tyrosinase related protein 2，TYRP2)共同構(gòu)成酪氨酸家族來調(diào)控黑色素的生物學合成過程。酪氨酸相關(guān)蛋白1是一跨膜蛋白，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，通過高爾基體轉(zhuǎn)運到黑色素體內(nèi)[13]。小鼠TYRP1基因位于4號染色體，定位至小鼠的brown位點，編碼537個氨基酸。人TYRP1基因位于9號染色體，包含8個外顯子和7個內(nèi)含子，但外顯子1不編碼，由外顯子2～8編碼，包含1個信號肽[14]。大多數(shù)物種TYRP1基因編碼蛋白由537個氨基酸組成，還含有1個信號肽區(qū)、2個銅原子結(jié)合域、2個富含半胱氨酸區(qū)域及大約6個糖基化位點[2]。TYRP1基因編碼的17個半胱氨酸集中于2個明顯的富含半胱氨酸區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域還含有表皮生長因子基序，有學者推測該區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)間的互作尤為重要[15]。關(guān)于TYRP1基因啟動子的研究，發(fā)現(xiàn)該基因啟動子區(qū)不存在典型的TATA框(TATA-box)和CCAAT框(CCAAT-box)，但存在一個保守的正向調(diào)控元件M-box(AGTCATGTGCT)，該元件能被堿性旋-環(huán)-螺旋(bHLH)家族的轉(zhuǎn)錄因子(上游刺激因子)識別[16]。

2 TYRP1基因的生物學作用

因TYRP1基因和TYR基因存在較高的同源性，所以對該基因的生物學作用一直存在著爭議，最早認為該基因具有過氧化氫酶的活性。有學者推測TYRP1基因也有酪氨酸酶和酪氨酸酶類似的活性，也有學者推測TYRP1基因參與左旋酪氨酸到多巴的轉(zhuǎn)換，是酪氨酸酶必要的協(xié)同因子。但從小鼠TYRP1基因功能的研究中發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白具有5,6-二羥基吲哚羧酸氧化酶活性，從而影響黑色素合成的下游途徑。有研究表明，酪氨酸酶活性的穩(wěn)定過程中，TYRP1基因發(fā)揮重要作用，并直接影響黑色素的生成[17]。而TYRP1基因在黑色素合成過程中起調(diào)控作用，并對黑色素細胞的發(fā)育、生存與功能起調(diào)節(jié)作用[11,18，19]。

3 TYRP1基因的多態(tài)性研究

將基因序列中某個堿基的突變、缺失和插入等引起基因編碼核苷酸順序的改變，從而造成其編碼蛋白的變化稱為基因的多態(tài)性[9]。動物毛色表型多種多樣，不同物種內(nèi)、同一物種或不同個體間所呈現(xiàn)的相似的被毛類型，因此任何動物毛色表型的分類均呈現(xiàn)潛在的毛色變異的遺傳基礎(chǔ)[10]。盡管TYRP1基因?qū)Σ煌纬傻臋C理尚不清楚，但對該基因多態(tài)性的研究在培育和創(chuàng)造新的毛色品種方面具有重要意義。

關(guān)于小鼠TYRP1基因的研究，Zdarsky等[20]發(fā)現(xiàn)，小鼠TYRP1基因編碼區(qū)存在4個突變位點造成其毛色表型的突變，分別是編碼區(qū)329 bp處存在一個G/A突變，即半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔野彼幔痪幋a區(qū)816 bp處存在一個C/T突變，使TaqⅠ酶切位點消失；編碼區(qū)977 bp處存在一個G/A突變，即組氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?；編碼區(qū)1 251 bp處存在一個G/A的同義突變。其中329，977，1 251 bp的突變起源是未知的，推測物種特異性可能是引起其變異的原因，而816 bp的突變只出現(xiàn)于棕色表型的小鼠。Sophie等[21]發(fā)現(xiàn)，小鼠染色體倒位會產(chǎn)生腹部白色背部棕色的表型。關(guān)于人TYRP1基因的研究，Boissy等[22]發(fā)現(xiàn)，一對非裔美國雙卵孿生兄弟(一個為白化病患者，另一個為正常膚色)中，白化病患者TYRP1基因外顯子6上缺失一個單堿基，從而使其放閱讀框被截斷，導致該基因編碼蛋白活性的喪失，對下游酪氨酸羥化酶的催化作用降低，最終形成Ⅲ型眼皮膚白化病。Manga等[23]發(fā)現(xiàn)，南非人所患的某種白化病與TYRP1基因突變(SNP：S166X和368delA)有關(guān)。Kenny等[24]發(fā)現(xiàn)，人TYRP1基因編碼區(qū)存在一個錯義突變(胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?，該突變與金色發(fā)色相關(guān)，并具有隱性遺傳特性。Kausar等[25]發(fā)現(xiàn)，巴基斯坦人TYRP1基因編碼區(qū)缺失22個堿基(c.647_668del)，從而使其放閱讀框被截斷，其表現(xiàn)呈現(xiàn)為金色或亮橘色的發(fā)色，棕色眼睛且中央凹發(fā)育不良，伴有眼球威震。Mukherjee等[26]發(fā)現(xiàn)，11個同族結(jié)婚的印度人TYRP1基因內(nèi)含子上存在一個單核苷酸多態(tài)性(SNP ID：rs2733832)，推測該變異位點可能與其膚色有關(guān)。關(guān)于馬TYRP1基因的研究，Rieder等[27]發(fā)現(xiàn)家馬TYRP1基因外顯子2上存在一個突變位點(C189T)，即蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍彼?，但該突變功能尚不明確；在內(nèi)含子2上也存在一個突變位點(A1188G)。且發(fā)現(xiàn)該基因與馬的銀白色、紅栗色、深褐色、及黑栗色表型有關(guān)。關(guān)于犬、貓等食肉目TYRP1基因的研究，Schmutz等[28]發(fā)現(xiàn)，犬TYRP1基因外顯子5上存在2個突變位點，分別是提前終止密碼子(Q331ter)和脯氨酸缺失(345delP)；外顯子2上存在一個錯義突變(S41C)，該突變位點與犬的棕色表型有關(guān)。Cargill等[29]通過連鎖分析發(fā)現(xiàn)，達爾馬西亞狗TYRP1基因的顯(B)/隱(b)性基因型可控制其黑/褐黃色斑。俞劍熊等[30]發(fā)現(xiàn)，拉布拉多犬的基因型為BB和Bb(2種基因型均為黑色)，但不含基因型bb(巧克力色)，在金毛獵犬中全為BB基因型(黑色)，并存在一個錯義突變(c.A990G)，推測可能由犬種之間的差異引起的。Lyons等[31]發(fā)現(xiàn)貓TYRP1基因共含有16個SNP，其中8個位于編碼區(qū)(沉默突變6個，氨基酸突變2個)，分別是密碼子第298處的一個堿基錯義突變，即精氨酸被終止密碼子(UGA)替代，此突變與肉桂色表型一致，另一個是內(nèi)含子6上的突變可能會擾亂了外顯子6的拼接識別位點。朱艷菲等[32]成功克隆了紅褐色烏蘇里貉與野生型烏蘇里貉TYRP1基因編碼區(qū)序列，但不存在突變位點。關(guān)于牛、羊等偶蹄目TYRP1基因的研究，Berryere等[33]發(fā)現(xiàn)，德克斯特牛TYRP1基因編碼區(qū)的一個單核苷酸多態(tài)性(H424Y)與其暗褐色表型相關(guān)。Gratten等[34]發(fā)現(xiàn)，索艾綿羊TYRP1基因外顯子4上含有一個非同義性突變(c.869T>C)與其淺色表型極顯著相關(guān)，但在不同毛色個體中表達量不同。鄭會芹[2]發(fā)現(xiàn)，山羊完整TYRP1基因共包含80個SNP，其中位于外顯子的有12個，內(nèi)含子中含有68個，其中g(shù).1263A>C處與其深色表型有關(guān)。Ren等[35]發(fā)現(xiàn)，豬TYRP1基因編碼區(qū)上缺失6個堿基TGGGTA(c.1484_1489del)，該突變與其褐色表型有關(guān)。關(guān)于鳥類TYRP1基因的研究，Nadeau等[36]發(fā)現(xiàn)，日本鵪鶉TYRP1基因外顯子3上存在一個T/C突變與其肉色羽毛相關(guān)，即苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸。徐瑩[37]發(fā)現(xiàn)，朝鮮鵪鶉TYRP1基因編碼區(qū)367 bp處存在一個T/C突變，即亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸；編碼區(qū)1 153 bp處存在一個 C/T 突變，即蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼?，這2個突變位點和其羽色之間無顯著相關(guān)，但降低TYRP1基因的表達量可能與其黑色羽毛有關(guān)。其他脊椎動物TYRP1基因的研究，Krauss等[38]發(fā)現(xiàn)，斑馬魚TYRP1A基因在蛋白質(zhì)的氨基末端存在一個突變位點，即Arg->Cys，該突變會引起黑色素細胞的死亡，且顏色表型與美拉尼西亞人金發(fā)和小鼠的褐色表型相似。

4 TYRP1基因在不同組織中的差異性表達分析

研究TYRP1基因在不同物種不同組織或器官中的差異性表達，對了解表差異性和TYRP1基因功能的關(guān)系，并為獲得不同毛色表型提供理論依據(jù)。Gratten等[34]發(fā)現(xiàn)，不同深淺色的索艾羊TYRP1基因的表達量與其毛色深淺無明顯相關(guān)。Nadeau等[36]發(fā)現(xiàn)，突變型和野生型日本鵪鶉TYRP1基因的表達量與其表型不存在明顯差異。但趙彥斌等[39]發(fā)現(xiàn)，黑線倉鼠皮膚組織中的TYRP1 mRNA的表達量是白化突變系的5.3倍，且TYRP1表達水平明顯高于白化突變系。Ko等[40]發(fā)現(xiàn)，黑羽鴨TYR基因和TYRP1基因的表達量較高于白羽鴨中的表達量。楊姍姍[41]將lpa-miR-nov-66轉(zhuǎn)染到羊駝黑色素細胞中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組TYRP1在mRNA和蛋白表達水平均顯著高于對照組。

5 不同物種間TYRP1基因生物信息學分析

不同物種同一基因的分子進化研究能為該基因在生物進化過程提供佐證，并為深入研究進化機制提供理論基礎(chǔ)。利用最大似然法對小家鼠、家牛和人等22個物種構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)不同物種間親緣關(guān)系與哺乳動物的進化分類最為接近。對上述物種TYRP1基因編碼區(qū)在進化中所承受的選擇壓力的研究，共發(fā)現(xiàn)13個正選擇位點，表明該基因主要承受負選擇作用[42]。

6 結(jié)論與展望

盡管許多研究發(fā)現(xiàn)TYRP1基因突變和許多動物棕色或褐色表型相關(guān)，該基因在不同物種、不同組織或器官中的表達量也存在差異，但TYRP1基因調(diào)控動物毛色的遺傳學分子機制仍需進一步探究。筆者建議可從以下層次開展研究，對TYRP1所屬的酪氨酸家族成員之間的互作來探究不同候選基因間的協(xié)同作用；對不同毛色的動物，尤其是提供優(yōu)質(zhì)毛皮的動物，檢測TYRP1基因在皮膚組織中的分布特征，以此揭示TYRP1基因編碼蛋白與不同毛色之間的關(guān)系；利用細胞生物學的相關(guān)知識來探究TYRP1基因在不同毛色動物皮膚組織中成熟黑色素細胞數(shù)量和分布特征。上述研究為闡明TYRP1基因引起的不同動物毛色變異與毛色表型及調(diào)控的動物毛色分子機制研究提供分子基礎(chǔ)，同時降低化工染料對環(huán)境污染的破壞，為開創(chuàng)綠色環(huán)保天然生物工程染料研發(fā)新的領(lǐng)域。

[1] Ghosh T C,Gupta S K,Majumdar S.Studies on codon usage in entamoeba histolytica[J].International Journal of Parasitology,2000,30:715-722.

[2] 鄭會芹.山羊TYRP1基因序列分析及SNPs研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學,2010.

[3] Wilczek A,Kondoh H,Mishima Y.Composition of mammalian eumelanins analyses of DHICA-derived units in pigments from hair and melanoma cells[J].Pigment Cell Res，1996,9(2):63-67.

[4] Cone R D,Lu D,Koppula S,et al.The melanocortin receptors:agonists,antagonists,and the hormonal control of pigmentation[J].Recent Prog Horm Res,1996,51:287-317,318.

[5] Hartmeyer M,Scholzen T,Becher E,et al.Human dermal microvascular endothelial cells express the melanocortin receptor type 1 and produce increased levels of IL-8 upon stimulation with alpha-melanocyte-stimulating hormone[J].J Immunol,1997,159(4):1 930-1 937.

[6] Box N F,Duffy D L,Chen W,et al.MC1R genotype modifies risk of melanoma in families segregating CDKN2A mutations[J].Am J Hum Genet,2001,69(4):765-773.

[7] 付冬麗.10個中國地方綿羊品種MC1R和ASIP基因多態(tài)性及其與毛色關(guān)聯(lián)性分析[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學, 2013.

[8] 楊民紅,李蘭會.動物皮毛色澤形成機制研究進展[J].貴州畜牧獸醫(yī)，2013,37(5):20-25.

[9] 劉曉妮,景炅婕,李寶鈞,等.ASIP和MC1R基因的研究進展[J].中國草食動物科學,2015,35(1):42-46.

[10] Ito S.The IFPCS presidential lecture:a chemist’s view of melanogenesis[J].Pigment Cell Res,2003,16:230-236.

[11] Jiménez-Cervantes C,Solano F,Kobayashi T,et al.A new enzymatic function in the melanogenic pathway. The 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase activity of tyrosinase-related protein-1(TRP1)[J].J Biol Chem,1994,269(27):17 993-18 000.

[12] Jackson I J,Chambers D M,Tsukamoto K,et al.A second tyrosinase-related protein,TRP-2,maps to and is mutated at the mouse slaty locus[J].EMBO J，1992,11(2):527-535.

[13] Ghanem G,Fabrice J.Tyrosinase related protein 1 (TYRP1/gp75) in human cutaneous melanoma[J].Mol Oncol,2011,5:150-155.

[14] 崔嘉,孫守榮,苗魯旭,等.TYRP1基因控制動物色素形成的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009,36(9):94-96.

[15] 吳立娟,彭曉霞,梁小云,等.眼皮膚白化病遺傳基因研究進展[J].廣州醫(yī)學院學報,2006,34(4):58-61.

[16] O'Reilly F M,Brat D J,McAlpine B E,et al.Microphthalmia transcription factor immunohistochemistry: a useful diagnostic marker in the diagnosis and detection of cutaneous melanoma, sentinel lymph node metastases, and extracutaneous melanocytic neoplasms[J].J Am Acad Dermatol,2001,45(3):414-419.

[17] 李春英.TRP-1在正常黑素細胞及惡性黑素瘤細胞中的作用研究[D].西安:第四軍醫(yī)大學,2003.

[18] Hearing V J.Biochemical control of melanogenesis and melanosomal organization[J].Journal of Investgative Dermatology Symposium Proceedings,1999,4(1): 24-28.

[19] Del Marmol V,Ito S,Jackson I,et al.TRP-1 expression correlates with eumelanogenesis in human pigment cells in culture[J].Febs Letters,1993,327(3):307-310.

[20] Zdarsky E,Favor J,Jackson I J.The molecular basis of brown, an old mouse mutation, and of an induced revertant to wild type[J].Genetics,1990,126(2):443-449.

[21] Javerzat S,Jackson I J.White-based brown (TYRP1B-w) is a dominant mutation causing reduced hair pigmentation owing to a chromosomal inversion[J].Mammalian Genome，1998,9：469-471.

[22] Boissy R E,Zhao H Q,Oetting W S,et al.Mutation in and lack of expression of tyrosinase-related protein-1(TRP-1) in melanocytes from an individual with brown oculocutaneous albinism:a new subtype of albinism classified as “OCA3”[J].The American Society of Human Genetics,1996,58:1 145-1 146.

[23] Manga P,Kromberg J G,Box N F,et al.Rufous oculocutaneous albinism in southern African Blacks is caused by mutations in the TYRP1 gene[J].Am J Hum Genet,1997,61(5):1 095-1 101.

[24] Kenny E E,Timpson N J,Sikora M,et al.Melanesian blond hair is caused by an amino acid change in TYRP1[J].Science,2012,336(6 081):554.

[25] Kausar T,Jaworek T J,Tariq N,et al.Genetic studies of TYRP1 and SLC45A2 in Pakistani patients with nonsyndromic oculocutaneous albinism[J].J Invest Dermatol,2013,133(4):1 099-1 102.

[26] Mukherjee M,Mukerjee S,Sarkar-Roy N,et al.Polymorphisms of four pigmentation genes (SLC45A2, SLC24A5, MC1R and TYRP1) among eleven endogamous populations of India[J].J Genet,2013,92(1):135-139.

[27] Rieder S,Taourit S,Mariat D,et al.Mutations in theagouti(ASIP),the extension (MC1R),and the brown (TYRP1) loci and their association to coat color phenotypes in horses (Equuscaballus)[J].Mamm Genome,2001,12(6):450-455.

[28] Schmutz S M,Berryere T G,Goldfinch A D.TYRP1 and MC1R genotypes and their effects on coat color in dogs[J].Mamm Genome,2002,13(7):380-387.

[29] Edward J Cargill,Thomas R Famula,Robert D Schnabel,et al.The color of a dalmatian’s spots: linkage evidence to support the TYRP1 gene[J].BMC Veterinary Research,2005,1(1):1-3.

[30] 俞劍熊,張雅麗,周子娟,等.拉布拉多犬與金毛獵犬毛色基因MC1R(R306ter)與TYRP1(Q331ter)SNP位點的檢測[J].實驗動物科學,2014,31(3):37-41.

[31] Lyons L A,Foe I T,Rah H C,et al.Chocolate coated cats: TYRP1 mutations for brown color in domestic cats[J].Mammalian Genome,2005,16(5):356-366.

[32] 朱艷菲,胡義潔,吳明明,等.紅褐色烏蘇里貉TYRP1基因的克隆及表達水平分析[J].遺傳育種, 2014,50(11):17-22.

[33] Berryere T G,Schmutz S M,Schimpf R J,et al.TYRP1 is associated with dun coat colour in Dexter cattle or how now brown cow？[J].Anim Genet,2003,34(3):169-175.

[34] Gratten J,Beraldi D,Lowder B V,et al.Compelling evidence that a single nucleotide substitution in TYRP1 is responsible for coat-colour polymorphism in a free-living population of Soay sheep[J].Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences,2007,274(1 610):619-626.

[35] Ren J,Mao H,Zhang Z,et al.A 6-bp deletion in the TYRP1gene causes the brown colouration phenotype in Chinese indigenous pigs[J].Heredity,2011,106:862-868.

[36] Nadeau N J,Mundy N I,Gourichon D,et al.Association of a single-nucleotide substitution in TYRP1 with roux in Japanese quail(Coturnix japonica)[J].Animal Genetics,2007,38(6):609-613.

[37] 徐瑩.TYR、TYRP1基因與朝鮮鵪鶉羽色相關(guān)性研究[D].洛陽:河南科技大學,2014.

[38] Krauss J,Geiger-Rudolph S,Koch I,et al.A dominant mutation in TYRP1A leads to melanophore death in zebrafish[J].Pigment Cell Melanoma Res,2014,27(5):827-830.

[39] 趙彥斌,孫兆增,白杰英,等.黑線倉鼠及其白化突變系TYR、TYRP1的基因表達水平比較分析[J].中國比較醫(yī)學雜志,2012,22(7):1-4.

[40] Ko J M,Yang J A,Jeong S Y,et al.Mutation spectrum of the TYR and SLC45A2 in patients with oculocutaneous albinism[J].Mol Med Report,2012,5(4):943-948.

[41] 楊姍姍.Lpa-miR-nov-66在羊駝黑色素細胞中的作用研究[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學,2014.

[42] 李麗莎,李祥龍,毛艷朋,等.山羊TYRP1基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)及功能的生物信息學分析[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2015,43 (10):147-152.

(責任編輯：朱寶昌)

Research Progress of Animal Coat Color Candidate Gene in Tyrosinase Related Protein 1(TYRP1)

LI Li-sha1,LI Xiang-long2

(1 Agriculture University of Hebei,Baoding Hebei,071000；2 Hebei Normal University of Science & Technology；China)

TheTYRP1 gene and its coding protein structure, function, polymorphism and the relationship between the expression in different tissues and the formation of the coat color were summarized, and the research ofTYRP1 gene in the future was prospected.

TYRP1 gene;animal coat color;research progress

10．3969/J．ISSN．1672-7983．2015．04．002

河北省高校創(chuàng)新團隊領(lǐng)軍人才培育計劃項目(項目編號：LJRC004)；河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃重點基礎(chǔ)研究項目(項目編號：15962901D)；河北省科技計劃項目(項目編號：15226302D)。

2015-11-04

S813.25

A

1672-7983(2015)04-0009-05

李麗莎(1989-)，女，在讀碩士。主要研究方向：動物遺傳育種。

*通訊作者，男，博士，教授，博士研究生導師。主要研究方向：動物遺傳育種。E-mail：lixianglongcn@yahoo.com。