變性梯度凝膠電泳（D GGE）技術(shù)在畜禽糞便厭氧發(fā)酵液中的研究進(jìn)展

王 欣，蘇小紅，郭廣亮，劉 偉，徐曉秋，高德玉

（黑龍江省科學(xué)院科技孵化中心，哈爾濱 150090）

變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGG E）目前是研究微生物群落的組成、多樣性和動態(tài)性最重要的檢測手段之一。傳統(tǒng)的研究方法僅限于對有限的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，然后研究其形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)等特征。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科研工作者將目光瞄準(zhǔn)在開發(fā)微生物資源上，并且采用DGG E技術(shù)分析環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)，以期發(fā)現(xiàn)對環(huán)境有用的微生物群落，然后開發(fā)微生物制劑。研究發(fā)現(xiàn)，微生物群落對有機(jī)物質(zhì)的礦化和氮、硫、磷等物質(zhì)的移除至關(guān)重要［1］。利用DGG E技術(shù)探討畜禽糞便厭氧發(fā)酵過程中微生物群落的各項指標(biāo)，能及時反應(yīng)系統(tǒng)中化學(xué)需氧量（COD）、揮發(fā)性脂肪酸（V F A）、氨氮、磷等的轉(zhuǎn)化情況，對以畜禽糞便為原料的厭氧發(fā)酵技術(shù)和環(huán)境科學(xué)的發(fā)展有著重要的現(xiàn)實意義［2］。

1 DGG E技術(shù)的原理及優(yōu)缺點

1.1 DGG E原理

變性梯度凝膠電泳技術(shù)［3］被應(yīng)用于環(huán)境微生物領(lǐng)域已有一定歷史，是基于雙鏈DNA片段在變性梯度膠中不同的遷移速度而產(chǎn)生的不同解鏈行為，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物中的長度相同序列不同的DNA標(biāo)記分離，從而獲得不同的條帶，每個條帶代表一類微生物菌群，條帶的強弱代表菌群的多少，可根據(jù)實際情況分析挑選出條帶較亮并具有代表性的片段切割回收［4-5］，并進(jìn)行測序分析，最終根據(jù)所得序列比對并判斷不同條帶所代表的優(yōu)勢菌群類別［6］。

1.2 DGG E技術(shù)優(yōu)缺點

目前DGG E技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分析環(huán)境中的藍(lán)細(xì)菌、細(xì)菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性，DGG E技術(shù)不但提供系統(tǒng)中優(yōu)勢種群信息，而且還能同時分析多個樣品，具有操作簡便和可重復(fù)性的優(yōu)點；然而由于現(xiàn)階段研究手段的局限性，使得DGG E技術(shù)也存在許多的問題，關(guān)于DGG E技術(shù)的優(yōu)缺點有以下幾點論述。

主要優(yōu)點：

第一，操作的簡便性。樣品可以不經(jīng)培養(yǎng)，直接提取樣品的總DNA，然后用細(xì)菌特定引物對其16s r DNA的可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DGG E直接分析擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對其條帶進(jìn)行切割測序［7］，一般在24h內(nèi)即可獲得結(jié)果。

第二，快速同時對比分析大量樣品。權(quán)春善等［8］采用DGG E技術(shù)探討了外界刺激對不同退化程度的內(nèi)蒙古草原土壤微生物多樣性的影響，經(jīng)DGG E分離獲得微生物群落多樣性的DGG E指紋圖譜表明，土壤經(jīng)過強酸、超聲波和高溫處理后，其微生物群落多樣性顯著降低，經(jīng)過強堿、漩渦震蕩處理，其豐富度顯著提高，而經(jīng)過氧化氫酶的刺激顯著提高了其豐富度。陳美軍等［9］利用DGG E技術(shù)研究分析了太湖地區(qū)真核微型浮游生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)不同湖區(qū)浮游生物的DGG E指紋圖譜存在顯著差異，表明營養(yǎng)水平低的湖區(qū)的浮游生物種類較多，豐富度高。

第三，能跟其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合。近年來，DGG E技術(shù)結(jié)合FIS H技術(shù)研究環(huán)境樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性是一種非常普遍和有用的手段，它能獲得微生物的質(zhì)量和數(shù)量信息，并能同時分析其空間分布特征［10］。DGG E技術(shù)與傳統(tǒng)方法結(jié)合，如雜交測序、克隆測序、R T-PCR等，從而為人們認(rèn)識更多的未知微生物資源提供有利途徑。

另外，DGG E還具有以下特性：突變檢出率高，突變檢出率為99%以上；檢測片段長度可達(dá)1kb，尤其適用于100～500 bp的片段；非同位素性，DGG E不需同位素?fù)饺?，可避免同位素對人體的傷害；重復(fù)性好，但該方法需要特殊的儀器，而且合成帶G C夾的引物也比較昂貴。

主要缺點：

第一，DGG E受影響的因素較多，要想獲得清楚的DGG E圖譜，就要優(yōu)化許多條件，如無菌操作、預(yù)處理、引物的選擇、PCR擴(kuò)增等條件。

第二，無法準(zhǔn)確給出微生物的代謝活性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)菌數(shù)量、基因表達(dá)水平及相互之間關(guān)系的信息［11］。

第三，由于現(xiàn)有分子生物學(xué)技術(shù)的局限性，DGG E不能保證將所有的具有一定差異的DNA片段完全分開，序列不同的DNA分子可能會遷移到凝膠的同一位置，可以考慮與傳統(tǒng)方法結(jié)合來解決這一問題。

2 DGG E技術(shù)在畜禽糞便厭氧發(fā)酵液中的應(yīng)用

畜禽糞便厭氧發(fā)酵液中含有較高濃度的COD、氨氮、磷以及未發(fā)酵完全的有機(jī)物等營養(yǎng)物質(zhì)［2］，采用DGG E技術(shù)對發(fā)酵液中的微生物種群結(jié)構(gòu)的各項指標(biāo)進(jìn)行分析，能及時反應(yīng)系統(tǒng)中化學(xué)需氧量（COD）、揮發(fā)性脂肪酸（V F A）、氨氮、磷等的轉(zhuǎn)化情況。目前國內(nèi)關(guān)于畜禽糞便高溫厭氧發(fā)酵液的DGG E技術(shù)報道較少，因此本文提出一種厭氧發(fā)酵液微生物多樣性的DGG E檢測試驗，包括以下幾個步驟［12-13］：

第一，試驗樣品基因組DNA的提?。喝?00m L發(fā)酵料液作為測試樣品，使用DNA提取試劑盒對樣品基因組DNA進(jìn)行提取。

第二，基因組16S r DNA的PCR擴(kuò)增：取1uL樣品基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板，分別采用1μL16S r DNA細(xì)菌通用引物P2、P3作為正反向引物，按照M ix配成25μL反應(yīng)體系，使用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：本試驗反應(yīng)體系采用降落PCR策略，即：預(yù)變性條件 94℃ 5m in，94℃ 45s，60℃ 30s，68℃1m in，循環(huán) 20次（每兩個循環(huán)降一度），94℃45s，48℃1m in，68℃ 1m in，循環(huán) 10 次，最后 68℃延伸 4m in。再用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存，以備后用。

第三，PCR反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳分析：經(jīng)反復(fù)試驗，確定本試驗的聚丙烯酰胺凝膠的變化濃度為45%～60%，具體制膠、點樣、染色、照相等操作步驟參照趙興青等人［14-17］的相關(guān)文獻(xiàn)。

3 結(jié)論與展望

厭氧發(fā)酵系統(tǒng)是處理畜禽糞便的有效途徑之一，而發(fā)酵液中各種微生物是維持系統(tǒng)穩(wěn)定運行的關(guān)鍵因子，本文分析了DGG E技術(shù)的原理及優(yōu)缺點，將DGG E技術(shù)應(yīng)用到畜禽糞便厭氧發(fā)酵液中，可以用來分析不同時期發(fā)酵液中不同微生物優(yōu)勢菌群的種類及數(shù)量變化，指導(dǎo)厭氧系統(tǒng)的穩(wěn)定運行。此外，隨著D EE G技術(shù)不斷發(fā)展，人們對環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性也有了越來越深刻的認(rèn)識。目前，能夠描述微生物全部群落結(jié)構(gòu)的單一技術(shù)還沒有發(fā)現(xiàn)，希望學(xué)者能加強這一技術(shù)的開發(fā)，為沼氣產(chǎn)生的微生物學(xué)機(jī)理研究奠定理論基礎(chǔ)。

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