不同產(chǎn)地口蘑多糖對亞急性衰老模型小鼠的抗衰老作用

楊 輝，王治寶，田嘉銘，譚曉虹

（河北北方學(xué)院 藥學(xué)系，河北 張家口 075000）

0 引言

蒙古口蘑屬傘菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae），口蘑屬（Tricholoma）真菌，在我國北方廣為分布[1].口蘑廣泛生長于內(nèi)蒙古、張家口等地，富含蛋白質(zhì)、多糖及多種微量元素[2]，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗腫瘤的活性[3].前期研究表明，口蘑水提取物對小鼠具有一定的抗應(yīng)激作用[4]，據(jù)此推斷口蘑可能具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)記憶功能的作用.

1956 年Harman 提出的衰老的自由基學(xué)說指出，機(jī)體內(nèi)存在有效的自由基清除系統(tǒng)，使體內(nèi)不斷產(chǎn)生的自由基維持在正常水平，這種平衡隨著年齡的增長逐漸被破壞，造成自由基過剩，過多的自由基與細(xì)胞膜中的類脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物丙二醛，與細(xì)胞損傷的程度呈正相關(guān)，可間接反應(yīng)組織中自由基含量的變化[5].

本試驗(yàn)建立了亞急性衰老模型[6]，通過對血清、肝臟組織及腦組織SOD、CAT、MDA 指標(biāo)的研究，探討內(nèi)蒙古產(chǎn)口蘑多糖和張家口產(chǎn)口蘑多糖對D-半乳糖致衰小鼠學(xué)習(xí)能力和抗氧化作用的影響.為壩上口蘑的綜合利用提供一定的依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

口蘑：內(nèi)蒙古集寧市和河北省康保縣；D-半乳糖：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；SOD、CAT、MDA 檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；人參總皂苷：南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)室用水為三蒸水.

UV-2100 紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；BS124 型精密電子天平：德國Sartorius；MR231 型高速冷凍離心機(jī)：德國SIGMA；Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)：上海吉量科技有限公司.

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量18～22 g，由河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 口蘑多糖供試液的制備[7]

準(zhǔn)確稱取內(nèi)蒙古口蘑粗粉和張家口口蘑粗粉各50 g，分別加入蒸餾水500 mL，溫提3 次，每次1 h，合并提取液，抽濾，將濾液減壓濃縮，用Sevage 法除去蛋白，濾液中加入乙醇使醇含量達(dá)80%，靜置過夜，抽濾，得粗多糖.將粗多糖加水溶解，加1%的活性炭脫色，抽濾，再加乙醇使醇含量達(dá)80%，靜置過夜，抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，真空干燥，得精制多糖.分別稱取內(nèi)蒙古口蘑精制多糖和張家口口蘑精制多糖適量，溶于水，得質(zhì)量濃度為400 mg/mL 的多糖溶液.

1.3.2 小鼠分組與給藥

選取90 只健康小鼠隨機(jī)分為正常對照組、衰老模型組、人參皂苷組、內(nèi)蒙古口蘑多糖組（低、中、高劑量）和張家口口蘑多糖組（低、中、高劑量），每組10 只.內(nèi)蒙古口蘑多糖組和張家口口蘑多糖組（低、中、高劑量）的給藥劑量分別為小鼠每10 g 體質(zhì)量給予10、20、40 mg 多糖溶液.人參皂苷組給藥劑量為小鼠每10 g 體質(zhì)量給予5.6 mg人參皂苷混懸液[8].正常對照組和衰老模型組的小鼠被灌服等體積的生理鹽水，每日一次.除正常對照組，其余組的小鼠均每天皮下注射10 g/L D-半乳糖生理鹽水溶液，注射量為0.2 mL，正常對照組注射生理鹽水0.2 mL，連續(xù)給藥30 d.

1.3.3 行為學(xué)試驗(yàn)

從開始給藥的第31 天開始進(jìn)行Morris 水迷宮測試[9].圓形水池中注入溫水，室溫及水溫均保持在（22±2）℃，平臺任意放置于某一象限的中心位置，并淹沒于水面下約2 cm 處.訓(xùn)練時(shí)將每只小鼠按東西南北4 個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池.測定小鼠自入水到找到站臺后四肢爬上站臺所需的時(shí)間（逃避潛伏期）.連續(xù)記錄6 d 小鼠的逃避潛伏期，取其平均值作為小鼠學(xué)習(xí)能力的檢測指標(biāo).

1.3.4 指標(biāo)檢測

行為學(xué)指標(biāo)檢測完畢后1 h，將小鼠斷頭取血，于3 000 r/min 離心制備血清，迅速取出小鼠的肝組織和腦組織制備10%（m/V）組織勻漿.血清指標(biāo)、肝臟組織及腦組織指標(biāo)均為SOD、CAT、MDA.

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以X±S 表示，組間比較采用單因素方差分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)蒙古口蘑多糖及張家口口蘑多糖對D-半乳糖致亞急性衰老小鼠學(xué)習(xí)能力的影響（表1）

在第1～4 天，各組小鼠的逃避潛伏期并無顯著差異.由表1 可知，在第5 天，模型組小鼠的逃避潛伏期比正常對照組小鼠的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01）；與模型組比較，內(nèi)蒙古口蘑多糖各劑量組及張家口口蘑多糖各劑量組的小鼠的逃避潛伏期均有縮短的趨勢，并有一定的劑量依賴性，但無顯著性差異；人參皂苷組與模型組相比，小鼠的逃避潛伏期縮短，但無顯著性差異.在第6 天，模型組小鼠的逃避潛伏期比正常對照組小鼠的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01）；與模型組比較，內(nèi)蒙古口蘑多糖各劑量組及張家口口蘑多糖各劑量組小鼠逃避潛伏期隨劑量的增加而縮短，且內(nèi)蒙古口蘑多糖中、高劑量組及張家口口蘑多糖中、高劑量組與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）；內(nèi)蒙古口蘑多糖高劑量組及張家口口蘑多糖高劑量組相比無顯著性差異；人參皂苷組與模型組相比，小鼠的逃避潛伏期有顯著性差異（P＜0.01）.

表1 各組小鼠逃避潛伏期(n=10，±S)Table 1 Escape latency of mice in each test group(n=10，±S)

表1 各組小鼠逃避潛伏期(n=10，±S)Table 1 Escape latency of mice in each test group(n=10，±S)

注：*為與正常對照組相比差異顯著（P＜0.05)；**為與正常對照組相比差異極顯著（P<0.01）；▲為與模型組相比差異顯著（P＜0.05)；▲▲為與模型組相比差異極顯著（P＜0.01)，下同.

2.2 小鼠血清指標(biāo)的測定（表2）

由表2 可知，連續(xù)注射D-半乳糖30 d 后，與正常對照組相比，衰老模型組小鼠的血清SOD 和CAT 活性均顯著降低（P＜0.05），而MDA 濃度極顯著升高（P＜0.01）.與衰老模型組相比，人參皂苷組，內(nèi)蒙古口蘑多糖中、高劑量組及張家口口蘑多糖中、高劑量組小鼠的血清SOD、CAT 活性均顯著升高（P＜0.05）；人參皂苷組，內(nèi)蒙古口蘑多糖低、中、高劑量組及張家口口蘑多糖低、中、高劑量組小鼠的血清MDA 濃度均顯著降低（P＜0.05）；內(nèi)蒙古口蘑多糖高劑量組、張家口口蘑多糖高劑量組及人參皂苷組3 者相比，SOD、CAT 活性和MDA 濃度均無顯著性差異.試驗(yàn)表明，內(nèi)蒙古口蘑多糖及張家口口蘑多糖可顯著提高衰老模型小鼠的血清SOD、CAT 活性，抑制MDA 濃度的上升，并表現(xiàn)出一定劑量依賴性.

表2 口蘑多糖溶液對小鼠血清指標(biāo)的影響(n=10，±S)Table 2 Influences of mushroom polysaccharides solution on serum indexes of mice (n=10，±S)

表2 口蘑多糖溶液對小鼠血清指標(biāo)的影響(n=10，±S)Table 2 Influences of mushroom polysaccharides solution on serum indexes of mice (n=10，±S)

2.3 小鼠肝臟組織指標(biāo)的測定（表3）

由表3 可知，與正常對照組相比，衰老模型組小鼠的肝臟組織中，SOD、CAT 活性均顯著降低（P＜0.05），MDA 濃度極顯著升高（P＜0.01）.與衰老模型組相比，人參皂苷組，內(nèi)蒙古口蘑多糖中、高劑量組及張家口口蘑多糖中、高劑量組小鼠的肝臟組織中SOD、CAT 活性均顯著升高，MDA 濃度均顯著降低（P＜0.05）；內(nèi)蒙古口蘑多糖高劑量組、張家口口蘑多糖高劑量組及人參皂苷組3 者相比，SOD、CAT 活性和MDA 濃度均無顯著性差異.試驗(yàn)表明，內(nèi)蒙古及張家口口蘑多糖可顯著提高衰老模型小鼠肝臟組織中SOD、CAT 活性，抑制MDA濃度的上升，并表現(xiàn)出一定劑量依賴性.

表3 口蘑多糖溶液對小鼠肝臟指標(biāo)的影響(n=10，±S)Table 3 Influences of mushroom polysaccharides solution on liver indexes of mice (n=10，±S)

表3 口蘑多糖溶液對小鼠肝臟指標(biāo)的影響(n=10，±S)Table 3 Influences of mushroom polysaccharides solution on liver indexes of mice (n=10，±S)

2.4 小鼠腦組織指標(biāo)的測定（表4）

由表4 可知，與正常對照組相比，衰老模型組小鼠的腦組織中SOD、CAT 活性均顯著降低（P＜0.05），MDA 濃度顯著升高（P＜0.05）.與衰老模型組相比，人參皂苷組，內(nèi)蒙古口蘑多糖低、中、高劑量組及張家口口蘑多糖低、中、高劑量組小鼠的腦組織中SOD、CAT 活性均顯著升高（P＞0.05），MDA濃度均顯著降低（P＜0.05）；內(nèi)蒙古口蘑多糖高劑量組、張家口口蘑多糖高劑量組及人參皂苷組3者相比，SOD、CAT 活性和MDA 濃度均無顯著性差異.試驗(yàn)表明，內(nèi)蒙古口蘑多糖及張家口口蘑多糖可顯著提高衰老模型小鼠腦組織中的SOD、CAT活性，抑制MDA 濃度的上升，并表現(xiàn)出一定劑量依賴性.

表4 口蘑多糖溶液對小鼠腦組織指標(biāo)的影響(n=10，±S)Table 4 Influences of mushroom polysaccharides solution on brain tissue indexes of mice (n=10，±S)

表4 口蘑多糖溶液對小鼠腦組織指標(biāo)的影響(n=10，±S)Table 4 Influences of mushroom polysaccharides solution on brain tissue indexes of mice (n=10，±S)

本試驗(yàn)通過對小鼠體內(nèi)衰老和抗衰老相關(guān)物質(zhì)的檢測發(fā)現(xiàn)，飼喂口蘑多糖后小鼠血清和肝腦組織中的SOD、CAT 活性升高，MDA 濃度降低.說明口蘑多糖在組織水平具有較好的抗衰老作用.從試驗(yàn)結(jié)果看，口蘑多糖可能是通過提高生物體內(nèi)SOD、CAT 等抗氧化酶的活性，降低過氧化脂質(zhì)分解的最終產(chǎn)物DMA 的含量，從而起到抗衰老的作用.

3 結(jié)論

通過對口蘑多糖的抗衰老作用的研究，證實(shí)口蘑多糖能增強(qiáng)小鼠記憶功能，并從衰老的自由基學(xué)說推斷，口蘑多糖具有抗氧化作用.同時(shí)，研究結(jié)果表明，內(nèi)蒙古口蘑多糖及張家口口蘑多糖在抗氧化方面作用相當(dāng).

［1］卯曉嵐.中國經(jīng)濟(jì)真菌［M］.北京:科學(xué)出版社，1998:69.

［2］王志寶，梁惠花.口蘑中多糖及主要營養(yǎng)成分含量的測定［J］.食用菌，2004（3）：42-43.

［3］Wang H X，Ooi V E C，Chang S T，et al.A polysaccharide-peptide complex from cultured mycelia of the mushroom Tricholoma mongolicum with immunoenhancing and antitumor activities［J］.Biochemistry and Cell Biology-Biochimie Et Biologie Cellulaire，1996，74（1）:95-100.

［4］王治寶，楊輝.壩上口蘑對小鼠抗應(yīng)激能力的影響［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（2）：139-141.

［5］孔鵬，姚翠鸞，齊麗薇，等.海帶多糖的抗衰老作用及其機(jī)理的研究［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（4）：63-66.

［6］王帥，蔣慧，席琳喬，等.小花棘豆黃酮對小鼠抗衰老作用的研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（5）：37-41.

［7］王文平，郭祀遠(yuǎn)，李琳，等.野木瓜中多糖提取工藝研究［J］.食品科技，2007，32（1）：90-101.

［8］于兆霞，陳正愛，鐘秀宏，等.桃仁乙醇提取物對亞急性衰老大鼠的抗衰老作用［J］.中國老年學(xué)雜志，2013，33（11）：2607-2608.

［9］羅小泉，駱利平，陳海芳，等.Morris 水迷宮檢測大鼠記憶力方法的探討［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，33（11）：2667-2669.