酶法純化玉米抗性淀粉工藝的研究

楊銘乾，黃繼紅，2*，許 茜，陶宜辰，馮軍偉，蘇雪鋒，王 文，李海月

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，河南 鄭州 450000）

0 前言

抗性淀粉（Resistant Starch，RS），是一種非常重要的功能因子，在20 世紀(jì)八九十年代被發(fā)現(xiàn)[1]，并定義為“健康人的小腸中不能被消化吸收的淀粉及其降解物的總稱(chēng)”[2]，具有更優(yōu)越于膳食纖維的生理功能和特性[3-4]，如緩解糖尿病，控制體質(zhì)量等[5-8].隨著人們對(duì)抗性淀粉研究的逐漸深入，其特殊的生理功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值逐漸展現(xiàn)于人們眼前，近年來(lái)越來(lái)越受到營(yíng)養(yǎng)界、醫(yī)學(xué)界和食品界的好感和關(guān)注.

抗性淀粉RS3 是淀粉經(jīng)過(guò)糊化之后凝沉而來(lái)的，現(xiàn)階段公認(rèn)的形成機(jī)理主要是直鏈淀粉分子之間回生形成雙螺旋結(jié)構(gòu)[9-10].目前抗性淀粉制備方法主要有高溫壓熱法、微波輻射法、酶法（單酶法或雙酶法）、酸法、擠壓法或多法相結(jié)合，但普遍存在抗性淀粉含量偏低的問(wèn)題.如余飛等[11]研究了普魯蘭酶處理?xiàng)l件對(duì)抗性淀粉增抗效應(yīng)的規(guī)律，并用普魯蘭酶處理糊化后的蠟質(zhì)玉米淀粉，在最優(yōu)條件下制得的抗性淀粉含量大于10%.劉一洋[12]利用酸酶（普魯蘭酶）法制備大米抗性淀粉，其RS 含量為24.31%；李俊偉[13]利用擠壓法制備大米抗性淀粉的含量為8.87%；吳享等[14]利用耐高溫α-淀粉酶聯(lián)合壓熱-冷卻循環(huán)處理制備玉米抗性淀粉，其含量為17.94%.作者針對(duì)上述抗性淀粉制備中含量低的問(wèn)題，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)壓熱和普魯蘭酶脫支得到的玉米抗性淀粉采用真菌α-淀粉酶進(jìn)行純化試驗(yàn)，研究了原抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶添加量、酶解時(shí)間對(duì)純化效果的影響；并通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)其純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為制備高純度抗性淀粉提供技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 材料

玉米淀粉：成武大地玉米開(kāi)發(fā)有限公司（含直鏈淀粉25%）；真菌α-淀粉酶（20 000 U/g）：山東隆大生物工程有限公司；抗性淀粉測(cè)定試劑盒：愛(ài)爾蘭Megazyme 公司.

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3E 雷茲pH 計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHA-C 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：金壇華峰儀器有限公司；湘儀TDZ5-WSTDZ5-WS 多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)：河南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；GZX-GF-MBS-Ⅰ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA12048 電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 抗性淀粉制備工藝

采用壓熱法與酶法相結(jié)合的方法制備玉米抗性淀粉，即將一定濃度的淀粉懸浮液經(jīng)過(guò)壓熱而斷鏈糊化之后，再加入普魯蘭酶進(jìn)行脫支處理，然后經(jīng)高溫作用使直鏈淀粉最大程度地溶出，4 ℃放置結(jié)晶，24 h 之后干燥粉碎即得抗性淀粉，以AOAC Official Method 2002.2 測(cè)得所得樣品抗性淀粉的含量為30.2%.

1.3.2 抗性淀粉純化方法

在一定的條件下，用真菌α-淀粉酶對(duì)按1.3.1制得的玉米抗性淀粉進(jìn)行酶解，以提高其抗性淀粉含量，酶解之后進(jìn)行離心，并洗滌沉淀，置于60℃烘箱中進(jìn)行干燥、粉碎得抗性淀粉，并對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定和提純率的計(jì)算，以綜合評(píng)價(jià)其純化效果.

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

預(yù)試驗(yàn)表明，酶法純化玉米抗性淀粉過(guò)程中，原抗性淀粉乳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、真菌α-淀粉酶的添加量和酶解時(shí)間是影響玉米抗性淀粉純化程度的主要因素，依次設(shè)計(jì)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行純化工藝條件的優(yōu)化，并確定酶法純化玉米抗性淀粉的最佳工藝條件.酶解溫度和酶解pH 值根據(jù)所購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品的最適條件進(jìn)行，不需進(jìn)行優(yōu)化.

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以原抗性淀粉乳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、真菌α-淀粉酶的添加量和酶解時(shí)間3 個(gè)因素為影響因素，利用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以獲得酶法純化玉米抗性淀粉的最佳工藝條件，其中各因素及水平見(jiàn)表1.

1.3.5 抗性淀粉含量的檢測(cè)

依據(jù)AOAC Official Method 2002.2 測(cè)定.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface optimization test

1.3.6 抗性淀粉提純率的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)純化效果的影響

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、20%、25%、30%的原抗性淀粉乳，添加真菌α-淀粉酶10 u/g，在一定的條件下酶解20 min，酶解完畢之后進(jìn)行離心洗滌及二次結(jié)晶，并于60 ℃下干燥，粉碎得純化樣品，按照AOAC 2002.02 方法測(cè)定其抗性淀粉含量，并計(jì)算其提純率，結(jié)果如圖1 所示，并對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析，如表2 所示.

圖1 原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)純化效果的影響Fig.1 Effect of mass fraction of raw resistant starch on purification

表2 原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的單因素方差分析Table 2 Single-factor ANOVA of raw resistant starch mass fraction

由圖1 可知，隨著原抗性淀粉乳濃度的增大，純化后的抗性淀粉的含量呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)，在原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%左右時(shí)達(dá)到最大值，且在此時(shí)提純率也達(dá)到最大值，可知適宜的底物（未轉(zhuǎn)化的淀粉）濃度有利于酶解反應(yīng)的高效進(jìn)行，在一定的酶量下，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，酶量充足，則酶解作用強(qiáng)；而當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí)，可能由于酶量不足或產(chǎn)生底物抑制，反而使得酶解作用逐漸減弱.由表2 可知，F(xiàn)=41.51676＞＞F0.05，表明該因素對(duì)純化效果影響顯著.

2.1.2 淀粉酶的添加量對(duì)純化效果的影響

在其他酶解條件不變的情況下，選取真菌淀粉酶的添加量依次為1、5、10、15、20、25 u/g，進(jìn)行純化試驗(yàn)，采用AOAC Official Method 2002.2 法測(cè)定純化后的抗性淀粉的含量，并計(jì)算其提純率，結(jié)果如圖2 所示，同時(shí)對(duì)測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，見(jiàn)表3.

圖2 真菌α-淀粉酶添加量對(duì)純化效果的影響Fig.2 Effect of addition amount of fungal α-amylase on purification

由圖2 可以看出，酶添加量也是影響抗性淀粉純化程度的重要因素之一，在添加量小于15 u/g時(shí)，隨著酶添加量的增大，抗性淀粉含量呈現(xiàn)增大趨勢(shì)；當(dāng)其大于15 u/g 時(shí)，抗性淀粉含量逐漸趨于恒定，其提純率也同樣如此.由此可知，在底物一定的前提下，當(dāng)酶量較低時(shí)，產(chǎn)物的生成與酶添加量成正相關(guān)；當(dāng)酶過(guò)量時(shí)，反應(yīng)完全，產(chǎn)物恒定，因此選擇酶添加量為15 u/g 為較佳條件.同時(shí)如表3 所示，F(xiàn)=276.660 2＞＞F0.05，表明酶添加量也顯著影響其純化效果.

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)純化效果的影響

在其他酶解條件不變的情況下，改變酶解時(shí)間依次為10、20、30、40、50 min，進(jìn)行純化試驗(yàn)，采用AOAC Official Method 2002.2 法測(cè)定純化后的抗性淀粉的含量，并計(jì)算其提純率，結(jié)果如圖3 所示，同時(shí)對(duì)測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，見(jiàn)表4.

表3 真菌α -淀粉酶添加量單因素方差分析Table 3 Single-factor ANOVA of addition amount of fungal α-amylase

由圖3 可以看出，不同的酶解時(shí)間得到的酶解效果也有所區(qū)別，當(dāng)酶解時(shí)間較短，即小于30 min時(shí)，純化效果隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)而增大；當(dāng)酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，即大于30 min 時(shí)，由于底物量固定，酶解完全，使得其結(jié)果逐漸趨于恒定.同時(shí)，如表4所示，F(xiàn)=103.839 5＞＞F0.05，可知酶解時(shí)間同樣對(duì)該抗性淀粉的純化效果影響顯著.

圖3 真菌α-淀粉酶酶解時(shí)間對(duì)純化效果的影響Fig.3 Effect of enzyme digestion time of fungal αamylase on purification

表4 真菌α-淀粉酶酶解時(shí)間單因素方差分析Table 4 Single-factor ANOVA of enzyme digestion time of fungal α-amylase

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)表1 設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5.

對(duì)表5 進(jìn)行回歸擬合，得到純化后抗性淀粉含量的回歸方程為：

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸方差和顯著性分析，其中純化后抗性淀粉含量的分析如表6 所示.

由表6 可知，本試驗(yàn)所建立的二次多項(xiàng)式模型極為顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.337 4＞0.005），因此該模型成立；回歸方程的決定系數(shù)為0.978 1，校正決定系數(shù)為0.949 9，說(shuō)明該模型能解釋94.99%的響應(yīng)值變化，擬合程度良好，可利用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)酶法純化抗性淀粉的工藝優(yōu)化.其中B、C、A2、C2都極為顯著（p＜0.01），表明在酶法純化抗性淀粉工藝中，真菌α-淀粉酶的添加量、酶解時(shí)間、原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的二次方和酶解時(shí)間的二次方對(duì)純化效果有顯著影響.

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 The design and results of response surface optimization test

表6 純化后抗性淀粉含量的回歸方程分析Table 6 ANOVA of regression equation for the content of RS after purification

圖4 為不同因子的響應(yīng)曲面和等高線圖，根據(jù)響應(yīng)曲面和等高線所呈現(xiàn)的結(jié)果，可以看出因素B、C，即真菌α-淀粉酶的添加量和酶解時(shí)間對(duì)純化后抗性淀粉的含量影響較大；依據(jù)純化后抗性淀粉含量與提純率的相關(guān)性可知，此兩因素同樣對(duì)提純率有著顯著影響，為影響純化效果的重要因素，與回歸方差分析結(jié)果一致.

圖4 響應(yīng)面曲面與等高線Fig.4 Plots of response surface and contour

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)純化后抗性淀粉含量的二次多項(xiàng)式模型進(jìn)行分析，求得最佳純化工藝條件為：原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.51%，真菌α-淀粉酶添加量20 u/g，酶解時(shí)間36.21 min，純化后抗性淀粉含量預(yù)測(cè)值為46.76%，提純率為54.84%.但考慮到操作的方便性，工藝參數(shù)修正為原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，真菌α-淀粉酶添加量20 u/g，酶解時(shí)間36 min，并采用此最佳條件進(jìn)行純化試驗(yàn)，重復(fù)3 次，測(cè)得純化后抗性淀粉含量平均為46.51%，此時(shí)提純率為54.01%，證明了此最佳純化條件的可靠性.

3 結(jié)論

酶法純化工藝可有效提高玉米抗性淀粉的純度，在其純化過(guò)程中原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)、真菌α-淀粉酶添加量和酶解時(shí)間均是主要的影響因素，應(yīng)控制原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，真菌α-淀粉酶添加量20 u/g，酶解時(shí)間36 min，有利于抗性淀粉含量的顯著增加.相比于原抗性淀粉，酶法純化工藝在確保安全健康的基礎(chǔ)上大大提高了其純度，為制備高純度抗性淀粉提供了基礎(chǔ)方法，有利于抗性淀粉制備研究的繼續(xù)進(jìn)行.

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