注射用頭孢他啶中吡啶的檢測(cè)方法研究

肖 燕，龔 浩，易秋艷，何宇新，李 銳

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都610039；2.四川省食品藥品檢驗(yàn)所，成都610039）

注射用頭孢他啶中吡啶的檢測(cè)方法研究

肖 燕1，龔 浩1，易秋艷2，何宇新1，李 銳1

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都610039；2.四川省食品藥品檢驗(yàn)所，成都610039）

目的對(duì)注射用頭孢他啶中吡啶的檢測(cè)方法進(jìn)行研究，為提高該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、臨床配制使用、合理包裝貯存及說明書修訂等提供參考。方法采用高效液相色譜（HPLC）法，外標(biāo)以吡啶含量為指標(biāo)，進(jìn)行檢測(cè)方法的線性關(guān)系試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)及穩(wěn)定性試驗(yàn)；對(duì)樣品進(jìn)行1個(gè)月加速試驗(yàn)、影響因素試驗(yàn)，比較該條件下產(chǎn)品質(zhì)量；對(duì)按產(chǎn)品使用說明書中的配制方法配制樣品溶液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，比較頭孢他啶中吡啶在不同配制溶液中的含量變化。結(jié)果吡啶線性回歸方程為Y=168 580X-2 451，R2=0.999 8，在0.055 2～0.661 9 μg內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；精密度試驗(yàn)吡啶色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.29%；穩(wěn)定性試驗(yàn)下，新舊吡啶對(duì)照溶液吡啶峰面積RSD為0.40%；影響因素試驗(yàn)，加速1個(gè)月試驗(yàn)注射用頭孢他啶中吡啶含量均未超出含量限度（0.4%）；3種頭孢他啶靜脈注射溶液隨時(shí)間的增加吡啶含量均有增加，避光下含量增加幅度略低于不避光，以生理鹽水組增加幅度最小。結(jié)論通過試驗(yàn)建立了吡啶的HPLC標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量檢測(cè)，其方法可靠，影響因素及加速試驗(yàn)可為該制劑包裝貯存提供參考，3種稀釋劑配置的注射液穩(wěn)定性試驗(yàn)可為提高該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、臨床合理配用、說明書的合理科學(xué)制定等提供參考。

頭孢他啶； 吡啶類； 色譜法，高效液相； 質(zhì)量控制

頭孢他啶（CAZ）為第三代半合成頭孢菌素，對(duì)多種β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對(duì)多種革蘭陽性菌與陰性菌均有殺菌作用，特別是對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌作用居頭孢菌素之首[1-3]。適用于治療單一細(xì)菌感染、2種及以上細(xì)菌引起的混合感染[4]。頭孢他啶通常采用以7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）、7-苯乙酰胺基-3-氯甲基頭孢烷酸對(duì)甲氧基芐酯（GCLE）為起始原料的合成路線來制備[5-7]。合成路線中涉及有機(jī)溶劑吡啶，與頭孢他啶的前體物質(zhì)的化學(xué)結(jié)合鍵不是非常牢固，在高溫、光照或貯存不當(dāng)時(shí)，其側(cè)鏈上的雜環(huán)可取代基脫落，產(chǎn)生游離吡啶，并在一定條件下發(fā)生聚合[8-9]，使得藥物的抗菌活性下降甚至消失，并可能會(huì)引發(fā)毒性反應(yīng)，影響藥物穩(wěn)定性與療效。國(guó)內(nèi)有關(guān)頭孢他啶中吡啶的檢測(cè)方法研究甚少，本文就此進(jìn)行研究，以期為提高該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，臨床配制使用、合理包裝貯存及說明書修訂等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 高效液相色譜儀[Watersalliance（Waters2487-2695）]；電子天平[METTLER TOLEDO XP205（d=0.01 mg）-Sartorius BSA2202S-CW（d=0.01g）]；pH計(jì)（METTLER TOLEDO SevenEasy S20）；超純水儀[MILLIPORE（MILLIPAK0.22 μm）]；培養(yǎng)箱（Thermo Scientific FORMA 311；BINDER KB400；MEMMENT LNE500）；原研廠葛蘭素史克生產(chǎn)的注射用頭孢他啶（復(fù)達(dá)欣）；注射用頭孢他啶抽檢樣品。磷酸二氫銨[分析純（≥99.0%），成都市科龍化工試劑廠]；磷酸二氫鉀[分析純（≥99.5%），廣東光華化學(xué)廠有限公司]；磷酸二氫鈉[分析純（≥99.0%），成都市科龍化工試劑廠]；吡啶[分析純（≥99.5%），成都市科龍化工試劑廠]；氨水[分析純（25%～28%），天津天大天發(fā)科技有限公司]；乙腈[色譜純（≥99.9%），SIGMAALORICH]；甲醇[色譜純（≥99.9%），F(xiàn)isher Scientific]。水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 吡啶對(duì)照貯備溶液：精密稱取吡啶約1 g，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取10 mL，置另一100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，于15℃以下貯存。pH7.0磷酸鹽緩沖液：稱取無水磷酸氫二鈉5.68g、磷酸二氫鉀3.63g，加水溶解并稀釋至1000mL。0.25 mol/L磷酸二氫銨溶液：取磷酸二氫銨57.515 g，用水溶解并稀釋至2 000 mL。吡啶對(duì)照溶液：臨用前精密量取2 mL吡啶貯備液，置于200 mL量瓶中，加pH7.0磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，作為吡啶對(duì)照溶液。供試品溶液：取注射用頭孢他啶樣品，按標(biāo)示量加水溶解并定量稀釋制成每1毫升含頭孢他啶6 mg的溶液，作為待測(cè)樣品溶液[8]。輸液樣品溶液：取頭孢他啶樣品9份，分為三組，每組3份。以使用說明書規(guī)定的稀釋劑（生理鹽水、5%葡萄糖注射液、乳酸鈉注射液）為溶劑，分別配制成含頭孢他啶20 mg/mL的溶液[10]。

1.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：SPOLAR C18柱（4.6 mm× 250.0 mm×5.0 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.25 mol/L磷酸二氫銨溶液-水（300∶100∶600）用氨溶液調(diào)節(jié) pH值至 7.0[12-13]；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 照高效液相色譜（HPLC）法（《中國(guó)藥典》2010版二部附錄ⅤD）測(cè)定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；吡啶峰理論板數(shù)應(yīng)不低于3000。取吡啶對(duì)照溶液精密進(jìn)樣高效液相色譜儀，以數(shù)次進(jìn)樣結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不得超過3.0%[10]。

1.2.3 吡啶含量測(cè)定的HPLC法驗(yàn)證[10，14]

1.2.3.1 線性關(guān)系考察 取 1.2.1中吡啶對(duì)照溶液（0.011 mg/mL）依次進(jìn)樣5、10、20、30、40、60 μL于高效液相色譜儀記錄色譜圖，積分測(cè)定吡啶峰面積。得到6次進(jìn)樣色譜峰重疊圖及吡啶進(jìn)樣量與測(cè)得的吡啶峰結(jié)果，以測(cè)得的吡啶峰面積為縱坐標(biāo)、吡啶進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制吡啶的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.3.2 精密度試驗(yàn) 取新配制的吡啶對(duì)照品溶液精密進(jìn)樣20 μL并重復(fù)操作5次，按照1.2.2相同色譜條件記錄重復(fù)進(jìn)樣色譜結(jié)果。以重復(fù)進(jìn)樣的吡啶色譜峰面積計(jì)算峰面積的RSD值。

1.2.3.3 對(duì)照溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 由于吡啶對(duì)照溶液在低溫下才穩(wěn)定，因此，其穩(wěn)定性試驗(yàn)為在5 d后新配吡啶對(duì)照溶液，與之前配制好的在低溫下貯存的舊對(duì)照溶液分別精密進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣3針，記錄色譜圖與峰結(jié)果。

1.2.4 樣品影響因素試驗(yàn)[12-14]（1）高溫試驗(yàn)：取 5批注射用頭孢他啶供試品適量，去除外包裝，不打開瓶蓋，以保持嚴(yán)封完整性。60℃溫度下放置10 d后取樣測(cè)定。（2）高濕度試驗(yàn)：同樣取供試品適量，去除外包裝，但不打開瓶蓋，準(zhǔn)確稱定試驗(yàn)前的質(zhì)量，再在25℃分別于相對(duì)濕度（90±5）%（干燥器下部放置硝酸鉀飽和溶液）條件下放置10 d后取樣，同時(shí)準(zhǔn)確稱量試驗(yàn)后供試品的質(zhì)量，以考察吸濕潮解性能。（3）強(qiáng)光照射試驗(yàn)：將供試品去除外包裝，但不打開瓶蓋，放在澄明度檢測(cè)儀下，于照度為（4 500±500）lx的條件下放置10 d（可用其配套的照度計(jì)來確定適宜照度所在的高度），于第10天取樣。將上述影響因素試驗(yàn)后的樣品，分別取樣3份以上，按上述1.2.1項(xiàng)下規(guī)定方法配制供試樣品溶液，按1.2.2項(xiàng)下色譜方法記錄頭孢他啶中吡啶的色譜峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算出其平均含量。

1.2.5 樣品加速1個(gè)月試驗(yàn)[14]供試品取10批，按市售包裝在溫度（40±2）℃、相對(duì)濕度（75±5）%的條件下放置1個(gè)月后取樣，按上述供試溶液同法配制，每批次重復(fù)測(cè)試3次。按1.2.2色譜條件記錄各供試品與對(duì)照品的色譜圖，以此計(jì)算吡啶的含量平均值。

1.2.6 臨床使用注射用頭孢他啶在3種靜脈注射溶劑中的穩(wěn)定性試驗(yàn)[11-14]在注射用頭孢他啶說明書中，其注意事項(xiàng)第8項(xiàng)為以生理鹽水、5%葡萄糖注射液或乳酸鈉稀釋頭孢他啶制成的靜脈注射液（20 mg/mL）在室溫下存放不宜超過24 h。故本試驗(yàn)對(duì)用上述3種溶液配制的頭孢他啶靜脈注射溶液進(jìn)行了日內(nèi)穩(wěn)定性考察，分別在避光和正常操作2個(gè)水平下，在設(shè)定的時(shí)間考察點(diǎn)（0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、24.0h）分別取對(duì)應(yīng)組別的樣品，精密進(jìn)樣20 μL于高效液相色譜系統(tǒng)，同法測(cè)定其中吡啶峰面積，以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算吡啶含量，探討在臨床使用中樣品的穩(wěn)定性，以及驗(yàn)證藥品說明書的科學(xué)性與可靠性，為臨床使用及說明書修訂提高提供參考。按樣品吡啶測(cè)定方法同法記錄以上3種溶液的六組測(cè)定結(jié)果，并將六組樣品測(cè)定的吡啶含量與時(shí)間繪制吡啶含量變化趨勢(shì)圖。

2 結(jié) 果

2.1 吡啶含量測(cè)定的HPLC法驗(yàn)證結(jié)果

2.1.1 線性關(guān)系考察結(jié)果 通過線性關(guān)系考察，得出回歸方程為Y=168 580X-245 1，R2=0.999 8。且理論塔板數(shù)均在8 000左右，遠(yuǎn)大于3 000，見圖1、表1。

圖1 吡啶線性色譜峰重疊圖

表1 吡啶進(jìn)樣量與測(cè)得的吡啶峰面積數(shù)據(jù)表

2.1.2 精密度試驗(yàn) 吡啶對(duì)照品溶液色譜峰面積RSD為0.29%，遠(yuǎn)低于要求的3.00%，見圖2、表2。

圖2 吡啶精密度試驗(yàn)色譜重疊圖

表2 精密度試驗(yàn)吡啶峰結(jié)果

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 5 d后新配吡啶對(duì)照溶液，與之前配制好在低溫下貯存的舊對(duì)照溶液重復(fù)進(jìn)樣的吡啶峰面積均值為337 310，理論塔板均在9 000以上，峰面積RSD為0.40%，見圖3、表3。

圖3 吡啶對(duì)照溶液穩(wěn)定性色譜圖

表3 吡啶對(duì)照溶液穩(wěn)定性峰結(jié)果

2.2 樣品影響因素試驗(yàn)結(jié)果 影響因素中高溫（60℃）的影響最大，會(huì)使注射用頭孢他啶中吡啶的含量明顯增加；而光照和高濕條件下，注射用頭孢他啶中吡啶含量改變不明顯，均在限度范圍內(nèi)，部分略有增加，部分反而降低。見表4。

表4 影響因素試驗(yàn)下吡啶含量計(jì)算結(jié)果（%）

2.3 樣品加速1個(gè)月試驗(yàn)結(jié)果 樣品加速1個(gè)月試驗(yàn)后，注射用頭孢他啶中吡啶含量的改變量均未超出《中國(guó)藥典》2010版對(duì)注射用頭孢他啶中吡啶含量限度（0.4%）的規(guī)定，該試驗(yàn)中的樣品是比較穩(wěn)定的，但樣品在溫度（40±2）℃、相對(duì)濕度（75±5）%條件下進(jìn)行了1個(gè)月加速試驗(yàn)后，吡啶的含量幾乎均有所增加，部分增加幅度接近最初含量的2倍。見圖4、表5。

圖4 注射用頭孢他啶1個(gè)月加速試驗(yàn)色譜圖

表5 1個(gè)月加速試驗(yàn)吡啶含量測(cè)定結(jié)果（%）

2.4 臨床使用注射用頭孢他啶在3種靜脈注射溶劑中的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 配制好的頭孢他啶靜脈注射溶液隨放置時(shí)間增加，其中的吡啶含量均明顯增加，而且?guī)缀醭示€性趨勢(shì)，避光放置下的增加幅度略小于不避光放置溶液，以葡萄糖配制的組別差異稍大；3種溶液比較，生理鹽水組中吡啶含量的增加幅度最小，頭孢他啶在3種溶液中穩(wěn)定性依次為：生理鹽水、0.5%葡萄糖、乳酸鈉。在16 h考察點(diǎn)，除生理鹽水外，另外2種溶劑制備的頭孢他啶溶液中吡啶含量超限（0.4%），乳酸鈉組在12 h考察點(diǎn)的吡啶含量臨近0.4%，生理鹽水組在24h考察點(diǎn)內(nèi)的吡啶含量在限度內(nèi)。見圖5、表6。

表6 3種頭孢他啶靜脈注射液中吡啶含量結(jié)果記錄

圖5 3種頭孢他啶靜脈注射液避光/不避光吡啶含量變化趨勢(shì)圖

3 討 論

HPLC法運(yùn)用于藥物分析檢測(cè)具有高效、精確、快速的特點(diǎn)。本試驗(yàn)通過線性關(guān)系考察、精密度及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)所用方法驗(yàn)證成立，精密度良好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，吡啶對(duì)照品進(jìn)樣量在0.055 2～0.661 9μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，方法穩(wěn)定可靠；所建立的標(biāo)準(zhǔn)線性曲線可以很好地用于吡啶含量測(cè)定，具有參考價(jià)值。樣品影響因素及1個(gè)月加速試驗(yàn)中，溫度對(duì)該制劑影響最大，其他因素相對(duì)次之，加速試驗(yàn)中測(cè)得的吡啶含量下降可能由試驗(yàn)中的各種誤差因素造成，重復(fù)可減小；隨著貯存時(shí)間增加，吡啶含量也隨之增加。提示，在分析檢驗(yàn)、運(yùn)輸儲(chǔ)存，生產(chǎn)及臨床使用中，應(yīng)尤其注意溫度條件，還應(yīng)控制好濕度、光照及其他條件，以保證藥效，減少不良因素導(dǎo)致的不良反應(yīng)。

在保證藥物制劑、生產(chǎn)、存儲(chǔ)環(huán)節(jié)下，臨床使用對(duì)制劑安全有效性的影響也很關(guān)鍵。本試驗(yàn)由臨床常用3種稀釋劑配制的頭孢他啶靜脈注射溶液的穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，稀釋劑的選擇對(duì)該制劑的藥效具有明顯影響，同時(shí)，靜脈注射液的使用時(shí)間對(duì)藥物療效也很關(guān)鍵。注射用頭孢他啶最好臨用新配，在可能的情況下，盡量選擇生理鹽水避光配制，以減少不良反應(yīng)。在選擇另外2種溶液配制頭孢他啶靜脈注射液時(shí)，應(yīng)盡量在12 h內(nèi)使用，以減少降解降低用藥風(fēng)險(xiǎn)，保證用藥安全與療效。同時(shí)，應(yīng)對(duì)藥品使用說明書的表述加以準(zhǔn)確細(xì)致化、科學(xué)化。

本研究對(duì)臨床使用具有指導(dǎo)意義，可為制劑包裝、貯存、檢驗(yàn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。從用藥安全有效出發(fā)，探索頭孢他啶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性，以強(qiáng)化藥品質(zhì)量控制、監(jiān)督與管理，指導(dǎo)臨床用藥及藥品分析檢測(cè)，保障人民群眾用藥安全有效，具有重要意義。

[1]蘇玉華.頭孢他啶的藥理作用及不良反應(yīng)分析[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2013，22（20）：73.

[2]楊靜，劉自玲，楊建，等.頭孢他啶與鈉鉀鎂鈣葡萄糖注射液的配伍穩(wěn)定性[J].藥學(xué)與臨床研究，2014（4）：344-346.

[3]張婷婷，魏增泉.臨床研究中的抗生素新藥[J].國(guó)外醫(yī)藥：抗生素分冊(cè)，2013，34（6）：241-244.

[4]薛雨，陳宇瑛.頭孢菌素類抗生素的最新研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志，2011，36（2）：86-92.

[5]宋榮軍.頭孢他啶藥劑研究[J].中外健康文摘，2012，9（1）：169-170.

[6]曹國(guó)文.頭孢他啶注射液與常用注射劑配伍的穩(wěn)定性[J].臨床合理用藥雜志，2011，4（12）：59-60.

[7]李彬，李永偉，龐艷龍，等.7-氨基-3-（1-吡啶甲基）頭孢烯酸氯化物的合成[J].河北化工，2007，30（1）：18-19.

[8]李鳳俠，王曉艷，王勇進(jìn)，等.頭孢他啶中間體及頭孢他啶合成方法[P].山東：CN102391289A，2012-03-28.

[9]屠潔，閆志剛，樓秋霞，等.頭孢他啶及其制劑的有關(guān)物質(zhì)分析及穩(wěn)定性研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33（2）：113-116.

[10]國(guó)家藥典編委會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：附錄174-176.

[11]張姮婕，孫雪奇，袁軍，等.HPLC測(cè)定注射用頭孢他啶中的有關(guān)物質(zhì)[J].中國(guó)抗生素雜志，2013，38（10）：752-755.

[12]陸瑤華.頭孢他啶在輸液中的穩(wěn)定性[J].華西藥學(xué)雜志，2007，22（4）：478-479.

[13]劉慶堂.三種頭孢菌素類藥物的輸液穩(wěn)定性影響因素研究[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2011，9（35）：152-153.

[14]陳宏杰.影響藥物制劑穩(wěn)定性的因素及解決辦法研究[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2013（19）：749-750.

Study of pyridine detection method in Ceftazidime for Injection

Xiao Yan1，Gong Hao1，Yi Qiuyan2，He Yuxin1，Li Rui1
（1.School of Food and Bioengineering，Xihua University，Chengdu，Sichuan 610039 China；2.Sichuan Provincial Institute for Food and Drug Control，Chengdu，Sichuan 610036，China）

ObjectiveTo study the detection method of pyridine in Ceftazidime for Injection to provide reference for increasing its quality standard，clinical dispensing use，rational package and storage，and revision of instruction.MethodsThe HPLC was adopted and the external standard used the pyridine content as the indicator，the linear relationship test，precision test and stability test for the detection method were conducted；the 1-month accelerated test and the affecting factors trial were conducted for comparing the quality of products under this condition；the sample solution prepared by adopting the methods in the product manual was performed the stability test for comparing the content change of pyridine in different prepared solutions.ResultsThe linear regression equation for pyridine was Y=168 580X-2 451，R2=0.999 8，there was a good linear relationship with peak area within the range of 0.055 2～0.661 9 μg；the precision test showed that RSD of pyridine chromatographic peak area was 0.29%；in the stability test，pyridine peak area RSD of the old and new pyridine control solution was 0.40%；in the influence factor tests，the 1-month accelerated tests showed that the pyridine content did not exceed the content limits（0.4%）；in three kinds of ceftazidime intravenous solution，the pyridine content was increased with time，the content increased range in avoiding light was slightly lower than that without avoiding light，which in the physiological saline group had smallest increase.ConclusionThe established HPLC standard curve of pyridine by tests can be used for the quantitative detection of pyridine；the method is reliable，the influencing factors and accelerated test can provide a reference for the packaging and storage of this preparation；the stability test of injection solution prepared by three kinds of diluents can provide reference for improvement of drug standards and quality control，reasonable clinical use and making reasonable scientific product manual and so on.

Ceftazidime； Pyridines； Chromatography，High Pressure Liquid； Quality Control

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.12.005

:A

:1009-5519（2015）12-1773-04

2015-02-04）

肖燕（1988-），女，四川德陽人，碩士研究生，主要從事功能性食品、天然藥物制劑及分析研究；E-mail：983534299@qq.com。

何宇新（E-mail：13981850645@126.com）。