聚醚醚酮種植材料TiO2顆粒噴砂處理的生物活性研究

吳曉綿，胡小蕾，鄧 鋒

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院/口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401147；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，重慶400015；3.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

聚醚醚酮種植材料TiO2顆粒噴砂處理的生物活性研究

吳曉綿1，2，胡小蕾3，鄧 鋒1，2

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院/口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401147；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，重慶400015；3.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016）

目的探討TiO2顆粒噴砂處理聚醚醚酮（PEEK）的最佳粒度范圍。方法用5種粒度范圍的TiO2顆粒（A～E組）對(duì)PEEK進(jìn)行噴砂處理，進(jìn)行表面粗糙度檢測(cè)，觀察細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞形貌，并檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）活性。結(jié)果PEEK的表面粗糙度隨著噴砂TiO2顆粒的粒度增大而增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)峰值的存在，細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)OD值的峰值出現(xiàn)在C組（180～212 μm TiO2顆粒進(jìn)行噴砂），數(shù)值為0.566 2。經(jīng)過(guò)14 d培養(yǎng)，成骨細(xì)胞ALP活性峰值出現(xiàn)在D組（＞212～355 μm TiO2顆粒進(jìn)行噴砂）。結(jié)論P(yáng)EEK表面噴砂的最佳TiO2顆粒粒度范圍為180～355 μm，可為今后PEEK表面改性研究提供重要參考。

骨和骨組織； 生物力學(xué)； 生物相容性材料； 堿性磷酸酶； 二氧化鈦； 聚醚醚酮

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床檢驗(yàn)和分析，發(fā)現(xiàn)鈦和鈦合金存在離子析出，并且與骨組織力學(xué)性能不匹配，這成為種植體周圍無(wú)菌性骨吸收和種植體失敗的主要原因[1-2]。與金屬和其他高分子種植體相比，聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）與骨組織力學(xué)性能更加匹配[1，3]。PEEK被認(rèn)為是金屬種植體最重要的替代材料之一，然而PEEK的生物惰性限制了它的生物學(xué)應(yīng)用[3]。表面粗糙度被認(rèn)為是生物材料生物活性最重要的參數(shù)之一[4]。多種方法被用于金屬種植體表面的改性，噴砂處理是其中被廣泛應(yīng)用的一種[1-3]。TiO2具有優(yōu)越的生物活性和穩(wěn)定性。有報(bào)道證實(shí)，對(duì)鈦種植體在骨皮質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定最好的TiO2噴砂顆粒的粒度范圍是180～212 μm[5]。作者對(duì)PEEK進(jìn)行TiO2顆粒噴砂處理表面改性的最佳粒度范圍進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 試劑與材料 根據(jù)前期研究利用Al2O3對(duì)PEEK復(fù)合物噴砂處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]，以及利用TiO2顆粒對(duì)鈦表面進(jìn)行噴砂的最佳粒度范圍（180～212 μm）[5]，將本研究進(jìn)行噴砂處理的TiO2顆粒分成A、B、C、D、E五組，顆粒分別為：75～96，＞96～109，180～212，＞212～355，＞355～500 μm（圖1）。PEEK粉末從Victrex（UK）獲得。成骨細(xì)胞系MG 63從ATCC（American type culture collection）獲得，培養(yǎng)于含雙抗的MEM培養(yǎng)基中。掃描電鏡型號(hào)為日本HitachiS-4800，噴金機(jī)為英國(guó)Quorum 550X，機(jī)械形貌儀為美國(guó)Dektek8 Stylus Profiler，Veeco。WST-1購(gòu)于德國(guó)RocheDiagnostics，堿性磷酸酶試劑盒購(gòu)于BioChain，蛋白濃度試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma。

1.2 方法 PEEK粉末在華東理工大學(xué)教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心采用壓縮成型法進(jìn)行樣品制備。樣品被切割成圓片狀（Ф 15 mm×2 mm）進(jìn)行表征和體外實(shí)驗(yàn)。樣品打磨到2000號(hào)進(jìn)行表面均一化，用機(jī)械形貌儀檢測(cè)的Ra值和Rg值。粗糙度Ra在0.1 μm以下的樣品被收集起來(lái)。進(jìn)行噴砂的時(shí)候圓盤(pán)到噴嘴的距離為10 mm，TiO2顆粒流擊打圓盤(pán)樣品表面的角度為90°，而氣流的壓力設(shè)定為0.5 MPa。在經(jīng)過(guò)噴砂過(guò)后，樣品用超聲清潔儀器在去離子水中進(jìn)行清潔。樣品再用表面形貌儀進(jìn)行檢測(cè)粗糙度。

圖1 制備的不同粒徑的噴砂用TiO2顆粒

在24孔板中，在具有不同粗糙度PEEK表面，以1 ×105/孔的最終細(xì)胞濃度進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)4 h培養(yǎng)后，移除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗PEEK樣品3次以去除沒(méi)有黏附的細(xì)胞，用WST-1的MEM培養(yǎng)基檢測(cè)黏附細(xì)胞的活力。成骨細(xì)胞MG63被種在PEEK的圓片上，在經(jīng)過(guò)不同的培養(yǎng)時(shí)間（3、7、14 d后），用含有4%戊二醛固定，乙醇梯度脫水，烘箱中干燥，噴金機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行噴金，再用掃面電鏡進(jìn)行細(xì)胞形貌觀察。將成骨細(xì)胞培養(yǎng)在PEEK表面，分別在培養(yǎng)3、7、14 d后用含WST-1的MEM培養(yǎng)液檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。經(jīng)過(guò)14 d的培養(yǎng)后，用Triton X-100裂解細(xì)胞，再用堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測(cè)成ALP活性，并用蛋白濃度試劑盒檢測(cè)總蛋白作為參比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有的數(shù)據(jù)利用OriginPro 8 SR3統(tǒng)計(jì)軟件（OriginLab Corporation，Northampton，MA），計(jì)量資料以±s表示；數(shù)據(jù)采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PEEK表面粗糙度 隨著顆粒TiO2粒度的增大而增加，見(jiàn)表1。Ra值從A組的（1.20±0.15）μm增長(zhǎng)到E組的（3.15±0.47）μm，而Rq值從A組的（1.50±0.15）μm增長(zhǎng)到E組的（3.96±0.69）μm。

2.2 細(xì)胞黏附 經(jīng)過(guò)4 h培養(yǎng)，OD值從A組（0.496 2± 0.046 9）增加到C組（0.566 2±0.020 7），再?gòu)腃組減少到E組（0.497 8±0.044 2）（圖2），在C組存在一個(gè)OD峰值，而且C組OD值與A、B、E組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 細(xì)胞形貌觀察 培養(yǎng)3、7、14 d后，細(xì)胞固定，并用SEM觀察（圖3）。經(jīng)過(guò)3 d培養(yǎng)，成骨細(xì)胞MG 63在C組顯得更加緊貼PEEK表面，看起來(lái)更加平坦。而在E組的成骨細(xì)胞顯得更加成梭形。

表1 經(jīng)過(guò)噴砂后5種樣品的表面粗糙度（±s，μm）

表1 經(jīng)過(guò)噴砂后5種樣品的表面粗糙度（±s，μm）

組別A組B組Ra Rq C組 D組E組1.20±0.15 1.50±0.15 2.40±0.56 2.70±0.59 3.15±0.47 1.50±0.15 1.92±0.24 2.94±0.68 3.41±0.87 3.96±0.69

圖2 5種PEEK材料的細(xì)胞黏附能力檢測(cè)

圖3 經(jīng)過(guò)3、7、14 d培養(yǎng)后的成骨細(xì)胞在5種PEEK表面的細(xì)胞形貌

2.4 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 在具有不同粗糙度的PEEK表面，經(jīng)過(guò)3 d的短期培養(yǎng)，細(xì)胞的增殖和活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是經(jīng)過(guò)7 d的長(zhǎng)期培養(yǎng)，C組（PEEK圓盤(pán)狀樣品用180～212 μm粒度的TiO2進(jìn)行噴砂處理）的成骨細(xì)胞WST-1檢測(cè)的OD值明顯強(qiáng)于B組（PEEK圓盤(pán)狀樣品用96～109 μm粒度的TiO2顆粒進(jìn)行噴砂）（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)14 d培養(yǎng)，五組的OD值均隨著TiO2顆粒的粒度增加而增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 經(jīng)過(guò)3、7、14 d培養(yǎng)后的成骨細(xì)胞MG63細(xì)胞增殖情況

2.5 ALP活性 經(jīng)過(guò)14 d培養(yǎng)，ALP活性隨著TiO2顆粒的增加而增加（圖5）。從A組增加到D組，E組則較D組下降。在D組存在著峰值。

圖5 經(jīng)過(guò)14 d培養(yǎng)后的成骨細(xì)胞ALP活性檢測(cè)

3 討 論

盡管大量研究報(bào)道了PEEK復(fù)合材料表面粗糙度能夠增強(qiáng)PEEK復(fù)合物的生物活性，但是TiO2噴砂處理對(duì)PEEK骨結(jié)合的最佳粒度范圍不明確[6]。本研究的目的是找出TiO2顆粒的最佳范圍，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。經(jīng)過(guò)噴砂處理過(guò)后PEEK的表面粗糙度隨著TiO2顆粒的粒度增大而增加（表1）。經(jīng)過(guò)在具有不同粗糙度的PEEK表面培養(yǎng)4 h，成骨細(xì)胞在C組（由180～212 μm TiO2顆粒進(jìn)行噴砂處理）培養(yǎng)細(xì)胞黏附能力顯著增高（圖2）。經(jīng)過(guò)7 d的培養(yǎng)，在C組的成骨細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)（圖4）。經(jīng)過(guò)14 d的培養(yǎng)，成骨細(xì)胞的增殖隨著表面粗糙度的增加而增加（圖4）。經(jīng)過(guò)14 d的培養(yǎng)，成骨細(xì)胞MG 3的ALP活性在D組出現(xiàn)峰值（圖5）。

種植體表面形貌和化學(xué)組成是其生物活性和骨結(jié)合的關(guān)鍵[7-8]。本研究中，PEEK的表面粗糙度隨著TiO2顆粒的粒度增大而增加（表1）。這個(gè)跟先前報(bào)道的鈦表面噴砂研究結(jié)果吻合。改善牙科和外科種植體生物活性的一種可能方法就是增加其表面粗糙度[9-11]。本研究關(guān)注TiO2噴砂作用的效果，而純的噴砂粗糙化的PEEK表面元素并沒(méi)有改變。

PEEK被證明是一種惰性材料，而這一特性并不利于其快速的骨結(jié)合[1，12]。本研究主要致力于找出對(duì)PEEK進(jìn)行TiO2噴砂的最佳粒度范圍。經(jīng)過(guò)在PEEK粗糙表面4 h培養(yǎng)，C組顯示出最大的OD峰值（圖2），經(jīng)過(guò)7 d的培養(yǎng)，成骨細(xì)胞在C組顯示出最大的OD值（圖4）。而經(jīng)過(guò)14 d的培養(yǎng)，成骨細(xì)胞在D組展現(xiàn)出最高的ALP活性（圖5）。用于TiO2顆粒進(jìn)行鈦表面噴砂的制備微米粗糙度對(duì)種植體在骨皮質(zhì)中保持穩(wěn)定的最佳的顆粒粒度為180～212 μm[5]。而本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)PEEK進(jìn)行噴砂的最好TiO2粒度范圍存在C組180～212 μm和D組＞212～355μm。

從粗糙度的角度來(lái)看，種植體粗糙度Ra的范圍應(yīng)該在1～4 μm[1，8]。有報(bào)道對(duì)種植體的粗糙度進(jìn)行了分級(jí)，Ra＜0.2 μm被認(rèn)為是光滑的，3～4 μm被認(rèn)為是粗糙的，＞6 μm被認(rèn)為是很粗糙的，本研究中所有組介于中度粗糙到粗糙之間，而且全部在1～4 μm。經(jīng)過(guò)3 d培養(yǎng)，在具有中度粗糙度的PEEK表面（圖3，C組）成骨細(xì)胞細(xì)胞形貌顯得更加平坦，在具有粗糙的PEEK表面（圖3，E組）顯得更加呈現(xiàn)為梭形。經(jīng)過(guò)14 d的培養(yǎng)，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果OD值提示，隨著TiO2顆粒粒度的增加OD值也隨著增加（圖4）。這可能是因?yàn)镻EEK表面越粗糙，能夠提供給細(xì)胞生長(zhǎng)的空間越大。

表面化學(xué)組成和形貌對(duì)種植的骨結(jié)合來(lái)說(shuō)非常重要。多種研究制備了旨在改善PEEK生物活性的PEEK復(fù)合物。經(jīng)過(guò)對(duì)PEEK表面的化學(xué)組成進(jìn)行了改善，但是這些研究對(duì)PEEK表面粗糙度的關(guān)注并不多。本研究用五組不同粒度的TiO2顆粒對(duì)PEEK進(jìn)行噴砂處理，并且找出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的多個(gè)峰值。這些結(jié)果提示，在應(yīng)用于牙科和外科方面，用TiO2顆粒對(duì)PEEK進(jìn)行噴砂處理存在最佳的粒度范圍應(yīng)該是180～355 μm。

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Studyon bioactivity of implant material polyether-ether-ketone processed by TiO2particles blasting

Wu Xiaomian1，2，Hu Xiaolei3，DengFeng1，2
（1.Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences/ChongqingMunicipalKeyLaboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education/College of Stomatology，Chongqing Medical University，Chongqing 400871，China；2.Department of Orthodontics，Stomatological Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400015，China；3.Key Laboratory of Clinical Laboratory Science，Ministry of Education，College of Laboratory Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing400016，China）

ObjectiveTo find out the best granularity range of TiO2particles blasting process on polyether-ether-ketone（PEEK）.MethodsFivekindsofgranulerangeofTiO2particles（group A-E）were utilized forconducting the surface blasting process on PEEK.The surface roughness was tested，the cell attachment，cell proliferation and cell morphology were observed and alkalinephosphatase（ALP）activitywasdetected.ResultsTheroughnessofblasted PEEKsurfacewasincreased astheincreaseofTiO2particles granularity.At the same time several peak values were found.In the cell attachment test，the peak OD value appeared in the group C（blasting by 180-212 μm of TiO2particles），which was 0.566 2.After 14 d culture，the peak value of osteoblast ALP activity appeared in the group D（blasting by＞212～355 μm of TiO2particles）.ConclusionThe best granularity range of TiO2particles for PEEK surface blasting is 180-355 μm，which can provide an important reference for the future study of PEEK surface modification in thefuture.

Bone and bones； Biomechanics； Biocompatible materials； Alkaline phosphatase； TiO2；Polyetheretherketone

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.12.001

:A

:1009-5519（2015）12-1761-03

2015-03-05）

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（31400808）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81271183）。

吳曉綿（1982-），男，廣東揭陽(yáng)人，講師，主治醫(yī)師，主要從事口腔醫(yī)學(xué)的臨床、科研與教學(xué);E-mail：wuxiaomian898@163.com。

鄧鋒（E-mail：deng63@263.net）。