室外培養(yǎng)參數(shù)對光合細菌生長的影響

黎建斌　李大列　黃光華　呂敏

摘要：本試驗選擇5 L無色透明聚乙烯塑料瓶作為培養(yǎng)容器，接種后置于室外自然光源下進行光照培養(yǎng)。采用單因子優(yōu)化試驗探討不同的光照度、初始pH值、初始接種濃度、氧需求程度、搖動次數(shù)等對光合細菌生長的影響。結(jié)果表明：其最適光照度6 000～8 000 lx、初始pH值為7.0～7.5、最佳接種量為30%、厭氧培養(yǎng)、每天搖動1～2次，一般培養(yǎng)6 d可使光合細菌活菌數(shù)≥4×109個/mL，雜菌率≤10%。

關(guān)鍵詞：光合細菌；室外；快速擴培

光合細菌（Photo Synthetic Bacteria簡稱PSB）是一類能夠在厭氧和光照條件下進行光合作用且不產(chǎn)生氧氣的一類細菌的總稱。它廣泛存在于自然界的湖泊、江河、海洋、水田、氧化池、活性污泥槽、污水溝內(nèi)，其菌體營養(yǎng)豐富，細胞干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量達60%以上，而且蛋白質(zhì)氨基酸組成齊全，含有機體必需的16種氨基酸且各種氨基酸的比例較合理。還含有豐富的B族維生素，尤其是維生素B12、葉酸、生物素等含量高[1]。大量的應用研究證明，光合細菌可明顯提高養(yǎng)殖動物的生長速度和抗病能力，而且具有重要的優(yōu)化水質(zhì)，改善養(yǎng)殖環(huán)境的功能，在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖和環(huán)境污水治理等領(lǐng)域都有非常重要和廣泛的應用前景。目前，對光合細菌培養(yǎng)條件的研究，國內(nèi)外已有許多相關(guān)報道，但眾說不一，均停留在室內(nèi)用燈光培養(yǎng)。這種培養(yǎng)方式耗能大、成本高，不利于光合細菌的推廣應用。因此，如何因地制宜利用空閑地在自然環(huán)境條件下快速擴培光合細菌已成為迫切需要解決的技術(shù)問題。為此，我們承擔了廣西直屬公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金自主選題項目“光合細菌快速擴培技術(shù)研究”，采用單因子優(yōu)化試驗考察不同的光照度、初始pH值、初始接種濃度、氧需求程度、搖動次數(shù)等對光合細菌生長的影響。

1試驗材料

1.1試驗菌株

試驗菌株P(guān)SB由廣西水產(chǎn)科學研究院南寧海可海樂微生物公司從高產(chǎn)蝦塘底泥中分離獲得并培養(yǎng)保存，經(jīng)鑒定為紅螺菌科沼澤紅假單胞菌（菌株編號NC01），活菌數(shù)≥4×109個/mL，雜菌率≤10%，深紅色，粘稠狀液體。

1.2培養(yǎng)基

液體配方：使用廣西水產(chǎn)科學研究院南寧海可海樂微生物公司優(yōu)化篩選的擴大培養(yǎng)基，其基本成分如下[2]： CH3COONa 3.3 g、KH2PO4 060 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 2.00 g、 MgSO4·7H2O 0.3 g、CaCl2 50 mg、MnSO4 25 mg、FeSO4 5.00 mg、酵母膏 1.0 g、調(diào)節(jié)pH值至 7.0、曝氣自來水 1 000 mL。

2光合細菌生長的測定

菌體濃度：用7504型分光光度計，在660 nm波長處，測定培養(yǎng)物光密度值（OD）；

細胞數(shù)量：用光合細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基[3]，以平板菌落計數(shù)法測定。

3室外培養(yǎng)參數(shù)的優(yōu)化

3.1光照度對光合細菌生長的影響

將活化后的菌種以30%接種于已滅菌的培養(yǎng)基中，置于室外自然光源下（溫度控制在35 ℃左右），采用增減遮陰網(wǎng)疏密來調(diào)節(jié)光照度，設(shè)置5個梯度：分別為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 lx，每個梯度設(shè)置2個重復，靜置培養(yǎng)6 d后取樣測定，探討其生長情況。

從表1可見，光合細菌在光照強度2 000～10 000 lx的范圍內(nèi)均可以生長，而且在2 000～8 000 lx范圍內(nèi)，光強度越大，光合細菌的生長速度就越快，生物量也越大，而且菌液粘稠均勻，無分層、無附壁。但在10 000 lx強光照度下，光合細菌的生長明顯受到了抑制，菌液顏色發(fā)生變化且分層、附壁現(xiàn)象較嚴重。因此，光合細菌比較適宜在光強度為6 000～8 000 lx下培養(yǎng)。在實際批量生產(chǎn)過程中可采用增減遮陰網(wǎng)疏密來調(diào)節(jié)光照度實現(xiàn)室外自然光照培養(yǎng)。

3.2初始pH值對光合細菌生長的影響

先配制液體培養(yǎng)基，采用1 mol/L的醋酸和5%碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的初始pH值。共調(diào)節(jié)6個梯度，分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每個梯度設(shè)置2個重復。將活化后的菌種以30%接種于已滅菌的培養(yǎng)基中，置于室外溫度控制在35 ℃左右、6 000 lx光照度下靜置培養(yǎng)6 d后取樣測定，探討其生長情況。

從表2得知，光合細菌在pH值6.5～9.0范圍內(nèi)均能良好生長，但不同的初始pH值對光合細菌生長產(chǎn)生不同影響。從測定的數(shù)據(jù)可以看出，各組之間，OD值、活菌數(shù)量差異明顯。初始pH 7.0時生長最好，OD值達1.98、最高活菌數(shù)量達4.38×109個/mL，其次是pH 7.5。最差是pH 9.0，OD值為0.65、最高活菌數(shù)量1.44×109個/mL。由于光合細菌的代謝產(chǎn)物為堿性，隨著培養(yǎng)時間的遞增，各組pH呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，光合細菌活菌數(shù)量也不斷增加。因此，在培養(yǎng)過程中，必須隨時測定和調(diào)整pH值，pH值過高或過低對光合細菌的生長都不利。為了延長光合細菌的對數(shù)生長期，當pH值上升超出最適范圍時，可以采用加1 mol/L的醋酸溶液調(diào)整菌液pH值。

3.3初始接種濃度對光合細菌生長的影響

將活化后的菌種以10%、20%、30%、40%、50%接種于已滅菌的培養(yǎng)基中，每個梯度設(shè)置2個重復。置于室外溫度控制在35 ℃左右、6 000 lx光照度下靜置培養(yǎng)6 d后取樣測定，探討其生長情況。

從表3得知，初始接種濃度對光合細菌生長的影響很大，初始接種濃度越高，光合細菌的生長就越快，達到最高活菌數(shù)量的時間就越短。比較不同初始接種濃度對光合細菌生長的影響發(fā)現(xiàn)，初始接種濃度在20%～40%時對最終的生物活菌數(shù)量影響不大，而初始接種濃度在10%時，光合細菌在培養(yǎng)液中很難占絕對優(yōu)勢，培養(yǎng)初期易長雜菌，生長緩慢。初始接種濃度在50%時，生長速度快、很容易形成優(yōu)勢菌群而抑制其他雜菌生長、培養(yǎng)周期較短，但從大批量生產(chǎn)的角度來講，成本相對較高；初始接種濃度低，培養(yǎng)周期相對有所延長，但成本降低。綜合考慮各方面的因素，在室外大批量生產(chǎn)中，建議采用30%初始接種濃度，相對延長培養(yǎng)時間的方法來提高活菌數(shù)量。

3.4氧需求程度對光合細菌生長的影響

氧需求程度的調(diào)控設(shè)置3個梯度，分別為：完全厭氧培養(yǎng)、有孔瓶蓋培養(yǎng)、開蓋培養(yǎng)，每個梯度設(shè)置2個重復。將活化后的菌種以30%接種于已滅菌的培養(yǎng)基中，置于室外溫度控制在35 ℃左右、6 000 lx光照度下靜置培養(yǎng)6 d后取樣測定，探討其生長情況。

從表4得知，光合細菌在完全厭氧、有孔瓶蓋培養(yǎng)、開蓋培養(yǎng)條件下均能進行正常的生理活動。但不同的氧需求程度對光合細菌最終的OD值、活菌數(shù)影響還是比較大的。在有孔瓶蓋培養(yǎng)條件下生長代謝最為旺盛，最高活菌數(shù)達4.31×109個。其次是完全厭氧，最高活菌數(shù)3.98×109個。最差是開蓋培養(yǎng)，由于雜菌感染，生長緩慢最高活菌數(shù)僅有2.26×109個。完全厭氧與有孔瓶蓋培養(yǎng)相比，差異不明顯，但與開蓋培養(yǎng)相比，則差異顯著。由于是室外培養(yǎng)，考慮到受天氣等外界條件的影響，因此采用完全厭氧培養(yǎng)方式是切實可行的。

3.5搖動次數(shù)對光合細菌生長的影響

搖動次數(shù)的調(diào)控設(shè)置3個梯度，分別為：每天搖動次數(shù)1次、2次和不搖動的培養(yǎng)方式。將活化后的菌種以30%接種于已滅菌的培養(yǎng)基中，置于室外溫度控制在35 ℃左右、6 000 lx光照度下靜置培養(yǎng)6 d后取樣測定，探討其生長情況。

從表5結(jié)果表明，在培養(yǎng)過程中適當搖動對光合細菌的生長還是非常有利的，搖動1次，2次的OD值、活菌數(shù)明顯高于不搖動。適當搖動可以使沉底的光合細菌上浮，在培養(yǎng)液中分布更加均勻，更好地獲得光照，從而促進細胞的更好生長。因此，在培養(yǎng)過程中建議每天搖動1～2次。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，光合細菌快速擴培最為關(guān)鍵的技術(shù)問題就是創(chuàng)造有利于光合細菌生長的良好環(huán)境及減少雜菌的污染。其最適光照度6 000～8 000 lx、初始pH值為7.0～7.5、最佳接種量為30%、厭氧培養(yǎng)、每天搖動1～2次，一般培養(yǎng)6 d可使光合細菌活菌數(shù)≥4×109個/mL，雜菌率≤10%，為在自然環(huán)境條件下快速擴培光合細菌提供有效的技術(shù)支撐。

參考文獻：

[1]

占家智，羊茜，吳青，等.水產(chǎn)活餌料培育新技術(shù)[M].北京：金盾出版社，2002

[2] 黎建斌，何為，李大列，等.高活性莢膜紅假單胞菌分離鑒定及應用[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2012，34（4）：540-543

[3] 邱宏端，騰蓉，陳雷鳴，等.莢膜紅假單胞菌應用型擴大培養(yǎng)液的優(yōu)化實驗[J].大連水產(chǎn)學報，2001，16（1）： 29-33

（收稿日期：2014-12-12）