纖維素酶的制備工藝及其商業(yè)化現(xiàn)狀研究

閆玉玲, 袁敬緯, 李 杰, 張 宏

纖維素酶的制備工藝及其商業(yè)化現(xiàn)狀研究

閆玉玲1, 袁敬緯2, 李 杰2, 張 宏3

（1. 遼寧石油化工大學，遼寧 撫順113001； 2. 中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江 肇東 151100；3. 中國石油遼河油田公司研究院，遼寧 盤錦 124010）

綜述了纖維素酶制備技術如固體發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、固-液交替新型發(fā)酵、固定化細胞技術、混菌發(fā)酵等方法。對各種工藝的流程、影響因素及優(yōu)缺點等進行了論述，并對纖維素酶制備的發(fā)展趨勢進行了探討；最后對纖維素酶的商業(yè)化生產(chǎn)現(xiàn)狀和主要的生產(chǎn)商進行了介紹。

纖維素酶；制備；固體發(fā)酵；液體發(fā)酵；固定化；混菌發(fā)酵；商業(yè)化

近年來纖維素乙醇獲得了較快發(fā)展，但距離大規(guī)模商業(yè)化運行還有一定的距離。其中制約其大規(guī)模商業(yè)化的主要原因之一是纖維素酶成本過高[1]。以產(chǎn)值計算，商業(yè)化纖維素酶制劑是全球第三大工業(yè)酶制劑。目前主要用于紡織、造紙、食品、飼料等行業(yè)。纖維素酶最大的工業(yè)需求領域將在纖維素乙醇制備方面，如果應用酶解技術生產(chǎn)乙醇、丁醇等生物燃料，那么纖維素酶將成為需求量最大的工業(yè)用酶[2]。發(fā)達國家如美、日等對纖維素酶的應用幾乎滲透到一切以植物為原料的加工業(yè)。同時，纖維素酶在廢水處理、環(huán)境保護以及基因、遺傳和細胞工程等各個生產(chǎn)領域也有大量的應用。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，纖維素酶制備工業(yè)進入到高速發(fā)展階段，制備技術將提高到一個新的水平。

1 纖維素酶的制備工藝

1.1 固體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶

固體發(fā)酵法(SSF)是指1種或多種微生物在沒有或幾乎沒有游離水的固態(tài)濕培養(yǎng)基上的生長過程和生物反應過程。固體發(fā)酵法又稱麩曲培養(yǎng)法。主要原料一般是麩皮、米糠等。農(nóng)作物秸稈、甘薯渣、玉米粉、豆粕、壓扁谷粒等通常也可以作為主要原料或輔助原料。

固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶工藝流程圖如1所示。首先對發(fā)酵原料滅菌，然后將菌種接入到與適當?shù)乃浞只旌系呐囵B(yǎng)基中，選擇適宜的溫度和濕度進行發(fā)酵，最后用緩沖溶液（或無菌水）抽提纖維素酶，即可得到粗酶液。

固體發(fā)酵法具有以下優(yōu)點[3]:①發(fā)酵條件接近于自然狀態(tài)下的真菌生長習性，產(chǎn)酶量一般比液體發(fā)酵法高出2～3倍，產(chǎn)生的酶系更全，有利于降解天然纖維素，固體纖維素酶曲可直接用于纖維素糖化。②次級代謝產(chǎn)物對菌體的分裂增值影響較小。③能耗低，發(fā)酵過程需要通入少量低壓無菌的空氣，不需攪拌。④固體發(fā)酵對水活度要求較低，發(fā)酵過程中可一定程度上避免外源性污染。⑤所用原料比較簡單，后處理設備少，生產(chǎn)成本低。

固體發(fā)酵法也存在缺陷：因為采用天然原料，易污染雜菌，生產(chǎn)的纖維素酶雜質含量高，因而精制困難。而且所產(chǎn)生的酶質量不穩(wěn)定，生產(chǎn)效率較低。因此，不能像液體發(fā)酵那樣大規(guī)模地擴大。

影響固態(tài)發(fā)酵的因素很多，如水分、培養(yǎng)基組分、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間以及固態(tài)基質的需氧量等。通常固態(tài)培養(yǎng)基中自由水含量很少，但是其中必須含有適量的水分，以吸附水的形式存在。除了水分外，培養(yǎng)基營養(yǎng)組分也很重要，因為不同的菌株對各種營養(yǎng)物質的需求不同；發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間也是影響纖維素酶活的重要因素，例如除個別嗜熱菌體固體發(fā)酵制備纖維素酶時的發(fā)酵溫度較高外，纖維素酶生產(chǎn)的最適宜溫度通常都在 28～30 ℃；發(fā)酵體系中充分的通氣量可以保證纖維素酶生長所需的充足的氧氣量。

1.2 液體深層發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶

液體發(fā)酵法(SP)是指將微生物接種到液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法。液體發(fā)酵法分為液體表層發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法。由于液體表層發(fā)酵法已基本被淘汰，本文主要討論液體深層發(fā)酵法。

纖維素酶液態(tài)發(fā)酵通常是將秸稈粉、玉米芯、麩皮等原材料經(jīng)粉碎等預處理后進行高壓蒸汽滅菌，然后送至發(fā)酵罐內，同時接入纖維素酶菌種，從罐底部通入無菌空氣進行物料的氣流攪拌，發(fā)酵過程控制適宜的溫度、pH值等發(fā)酵條件，其工藝流程如圖2所示。

液體深層發(fā)酵技術具有自動化程度高、包容性及發(fā)酵容量大等優(yōu)點，西方發(fā)達國家己逐步用該技術取代固體發(fā)酵技術來生產(chǎn)各種抗生素及酶制劑,目前國內外大都在探索液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶。但液體發(fā)酵法也存在動力消耗大、設備要求高、生產(chǎn)成本高等缺點。

培養(yǎng)基組分、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH值、通風攪拌量等是影響液體發(fā)酵產(chǎn)酶的主要因素。其中培養(yǎng)基組分是關鍵，合適的營養(yǎng)源（包括碳源、氮源無機鹽和其他微量元素）配比是發(fā)酵產(chǎn)酶的基礎。為了降低成本，纖維素酶生產(chǎn)的碳源和氮源可以采用廉價廢棄物，這方面的研究工作由于具有明顯的實用性而越來越受到人們的青睞。發(fā)酵溫度和 pH值的變化可以引起微生物代謝途徑發(fā)生變化，對細胞內各種酶的活性有較大影響。通風攪拌量決定了發(fā)酵液中溶氧量的大小及微生物細胞與營養(yǎng)底物的接觸情況。除此之外，由于真菌纖維素酶是胞外酶，具有可誘導性，因此發(fā)酵中可以添加誘導劑和表面活性劑來提高產(chǎn)酶量[4]。

1.3 其他發(fā)酵工藝

1.3.1 固-液交替新型發(fā)酵工藝

如前所述，液體發(fā)酵較之固體發(fā)酵具有更多優(yōu)點，因此工業(yè)上較多采用了液體發(fā)酵來大規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶，但液體發(fā)酵之培養(yǎng)周期長和廢水難處理等問題，制約了纖維素酶的生產(chǎn)。如果能將兩種發(fā)酵模式結合起來，充分發(fā)揮二者的優(yōu)點，會給傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝帶來革新，從而提高纖維素酶活性及產(chǎn)率。目前在纖維素酶生產(chǎn)中使用的生物床及固定化細胞等技術，就是有效地將固體發(fā)酵與液體發(fā)酵相融合的典范，綜合兩者的優(yōu)點，更適于規(guī)?；a(chǎn)。

1.3.2 固定化細胞技術

固定化細胞技術是利用物理或化學手段將游離細胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持活性，以達到反復利用的目的。

固定化細胞與游離細胞相比，具有能使發(fā)酵罐內細胞濃度提高、遺傳性質穩(wěn)定、細胞可重復或連續(xù)使用等特點[5]。同時，固定化技術具有減少對細胞的剪切傷害，提高產(chǎn)物的制備效率，提高產(chǎn)品收率，方便產(chǎn)物回收，同時可降低產(chǎn)物的生產(chǎn)成本，實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)等優(yōu)點。 目前，因為結合了固體發(fā)酵與液體發(fā)酵的優(yōu)點，固定化細胞技術己被廣泛應用于纖維素酶生產(chǎn)中，該技術能在一定程度上解決維素酶制備中遇到的問題，提高纖維素酶產(chǎn)品的性能。

目前固定化細胞載體主要有3大類：第1種是無機載體，如活性炭、多孔陶珠、紅磚碎粒、沙粒、微孔玻璃、高嶺土、硅藻土等。第2種是有機高分子載體，又分為天然高分子材料（如瓊脂、角叉萊膠、明膠、海藻酸鈉等）和有機合成高分子凝膠載體（如聚乙烯醇(PVA)凝膠、聚丙烯酰胺(ACRM)凝膠等），其中前一種無生物毒性、傳質性好，但強度低，在厭氧條件下易被生物分解，而后一種強度較好，但傳質性能較差。第3種是復合載體，由有機載體材料和無機載體材料結合而成，復合載體可實現(xiàn)有機和無機兩類載體材料在許多性能上的優(yōu)勢互補。

應用于微生物細胞固定化的方法主要有包埋法、吸附法、交聯(lián)法和截留法，其中前兩種方法最為常見。

1.3.3 混菌發(fā)酵

混菌發(fā)酵也稱共發(fā)酵，一般指采用2種或2種以上微生物協(xié)同作用共同完成發(fā)酵過程的發(fā)酵技術，是純種發(fā)酵技術的新發(fā)展。該技術操作簡單，且可以提高發(fā)酵效率甚至形成新產(chǎn)品，從而取得與復雜DNA體外重組技術類似的效果。進行混菌發(fā)酵時，由于不同菌種產(chǎn)生的纖維素酶系不同，產(chǎn)生多種不同功能的酶將作用于纖維素的不同位點，這就可以彌補菌種之間的差異，將各酶系之間的協(xié)同作用發(fā)揮最大化，從而最大限度提高纖維素酶的活性及產(chǎn)量。除了可以對酶的各組分進行補充優(yōu)化，混菌發(fā)酵還能減弱一些發(fā)酵過程中的抑制作用。

木霉菌與曲霉菌混菌發(fā)酵可以得到較優(yōu)的纖維素酶產(chǎn)品，木霉和青霉混合發(fā)酵也可使纖維素酶活性大幅度提高。這已經(jīng)成為該領域許多研究工作者較常采用的共發(fā)酵策略。例如，里氏木霉所產(chǎn)的纖維素酶系中β-葡萄糖苷酶活性低，為了克服這一缺點，Kumar R等[6]利用黑曲霉和里氏木霉1:3混菌發(fā)酵，研究結果表明混合發(fā)酵后內切葡萄糖苷酶活性和外切葡萄糖苷酶活性都能提高31%～35%，同時β-葡萄糖苷酶活性提高40%；Ahamed A等[7]用黑曲霉LMA和里氏木霉RUT-C30混合發(fā)酵，結果表明濾紙酶活達到了 7.1 U/mL,較單菌發(fā)酵的提高了 108.8%；張繼泉等[8]在黑曲霉和煙曲霉固態(tài)發(fā)酵中接入少量假絲酵母混合培養(yǎng)，研究其對纖維素酶活性的影響。結果發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵后黑曲霉和煙曲霉纖維素酶系中濾紙酶、羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶及淀粉酶的活性均有明顯提高。然而，不是任意的菌株都能用來混菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，菌種搭配時要注意菌株之間的相容性[9]。

2 纖維素酶制備工藝的發(fā)展趨勢

運用各種科學方法提高纖維素酶的活力和產(chǎn)量已成為酶解工程的重要課題。先進的纖維素酶生產(chǎn)工藝，將為纖維質原料在新能源領域的應用提供廣闊的平臺。

目前，采用液體深層發(fā)酵方式制備纖維素酶是大部分商業(yè)酶制劑公司的首選。這在一定程度上體現(xiàn)了該技術在生產(chǎn)木質纖維素酶產(chǎn)品方面的綜合經(jīng)濟優(yōu)勢。但它也存在諸多缺點。開發(fā)符合纖維素乙醇工程化要求的液體發(fā)酵新技術，是優(yōu)化纖維素酶發(fā)酵工藝的途徑之一。采用新型發(fā)酵工藝如固定化細胞發(fā)酵、混菌發(fā)酵等將是纖維素酶制備方法的發(fā)展趨勢。固定化細胞發(fā)酵產(chǎn)酶技術不但有利于提高纖維素酶的產(chǎn)率，而且可以實現(xiàn)其連續(xù)化生產(chǎn)，其中細胞固定化材料的選擇和固定化方法的確立是關鍵?；旌暇l(fā)酵產(chǎn)酶技術可以產(chǎn)生多種不同功能的酶并且作用于纖維素的不同位點, 充分發(fā)揮各酶之間的協(xié)同作用，從而提高酶的活性，并彌補菌種之間的差異。大量研究己聚焦于固定化細胞發(fā)酵和混菌發(fā)酵制備工藝上，以期獲得優(yōu)質的木質纖維素酶產(chǎn)品。這些年，這幾種新型發(fā)酵技術研究已取得了可喜的實驗室成果，但很多工作尚處于探索階段，今后有待深入探索，力爭在工業(yè)上應用。

3 纖維素酶的商業(yè)化生產(chǎn)

20 世紀 90 年代，每加侖纖維素乙醇的酶成本約為 5美元。為了降低酶費用，許多大的酶制劑公司紛紛研究開發(fā)高效、低成本的纖維素水解酶。2011年杰能科公司（Genencor）在Accellerse DUET 基礎上推出新一代的纖維素復合酶Accellerase? TRIO產(chǎn)品[10]，該產(chǎn)品可用于SSCF 發(fā)酵工藝，具有處理高濃度底物能力強，酶用量減半的優(yōu)勢。

2012 年諾維信公司（Novozymes）在其上一代商業(yè)酶 CTec2的基礎上推出酶制劑產(chǎn)品 Cellic CTec3[11]，該產(chǎn)品較上一代產(chǎn)品在溫度和酸堿度的適應范圍上大有提高，轉化效率較上一代提高了50%；丹麥DSM 公司也推出了商業(yè)應用的纖維素水解酶，為Inbicon 纖維素乙醇生產(chǎn)裝置提供水解用酶。表1列出了商業(yè)化生物煉制纖維素酶生產(chǎn)商代表產(chǎn)品主要信息。國際上幾家大的酶制劑公司概況見表1。

［1］ 張宇，許敬亮，袁振宏，等.世界纖維素燃料乙醇產(chǎn)業(yè)化進展[J].當代化工，2014，43（2）：198-202；206.

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［3］ Singhania R R, Patel A k, Soccol C R, Pandey A. Recent advances in solid-state fermentation[J]. Biochem. Eng.J., 2009,44:13-18.

［4］ 楊濤.水稻秸稈纖維素發(fā)酵轉化燃料乙醇的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2008.

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［12］Anuj K C,Chandrasekhar G,Messias B S,et al.The realm of cell ulases in biorefinery development[J].Critical Reviews in Biotech nology,2012,32(3) :187-202.(TRIO_ProductSheet _LowRes. Pdf)

Preparation Processes of Cellulase and Their Commercialization

YAN Yu-ling1，YUAN Jing-wei2,LI Jie2,ZHANG Hong3
(1. Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 13001, China；2. COFCO Biochemical Energy(Zhaodong)Co.,Ltd.,Heilongjiang Zhaodong 151100, China; 3. Research Institute of Exploration and Development,PetroChina Liaohe Oilfield Company,Liaoning Panjin 124010, China)

The preparation processes of cellulose were summarized, such as solid fermentation, liquid fermentation, solid-liquid alternate new fermentation, the immobilized cell technology and mixed fermentation. And technological process flows, influence factors, advantages and disadvantages of each process were discussed. And development trend of the cellulose preparation process was analyzed. At last, commercial production status and main producers of cellulose were introduced.

Cellulase；Preparation；Solid fermentation；Liquid fermentation; Immobilization；Mixed fermentation；Commercialization

TQ 214

： A

： 1671-0460（2015）05-0988-03

2015-04-14

閆玉玲（1980-），女，甘肅張掖人，編輯，碩士，2009年畢業(yè)于遼寧石油化工大學生物化工專業(yè)，從事纖維素酶制備研究及科技編輯工作。E-mail：yulingyan1981@126.com。