梔子黃多酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性研究

陳 陽，張 浩，王文君，向燦輝，何曉彤，蔡 樂

（1.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)化學教研室,廣東珠海519041；2.四川大學華西藥學院生藥學教研室,四川成都610041；3.云南大學化學科學與工程學院，教育部自然資源藥物化學重點實驗室，云南昆明650091）

梔子黃多酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性研究

陳 陽1，張 浩2，王文君1，向燦輝1，何曉彤1，蔡 樂3，﹡

（1.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)化學教研室,廣東珠海519041；2.四川大學華西藥學院生藥學教研室,四川成都610041；3.云南大學化學科學與工程學院，教育部自然資源藥物化學重點實驗室，云南昆明650091）

目的：揭示梔子黃抗氧化能力是否與多酚含量有關(guān)，為梔子黃中抗氧化能力成分的確定提供線索。方法：分別采用還原能力實驗、DPPH自由基清除能力實驗和亞鐵離子螯合實驗測定西紅花苷、綠原酸、梔子粗提物和梔子黃的抗氧化活性，同時分別采用HPLC和UV來測定梔子粗提物和梔子黃中西紅花苷和多酚的含量。結(jié)果：在還原能力和DPPH自由基清除活性模型中，梔子黃色素中起抗氧化作用的主要化學成分是多酚類，而不是西紅花苷。另一方面，與前兩個模型不同，西紅花苷和多酚類成分都具有明顯的亞鐵離子螯合活性，梔子黃中具有螯合活性的主要化學成分同時包括西紅花苷和多酚類。結(jié)論：結(jié)合前期研究結(jié)果推測，梔子黃抗氧化作用的主要化學成分是多酚類，而西紅花苷具有明顯的亞鐵離子螯合活性。

梔子黃，西紅花苷，多酚，抗氧化，UV，HPLC

梔子黃是從茜草科植物梔子果實（gardenia fruits）中提取的黃色素，是國內(nèi)外使用最廣泛、穩(wěn)定性能較好的食用天然黃色素之一，在亞洲各國廣泛用作食品色素。西紅花苷（crocins）是梔子黃色素的主要成分[1]，具有保護心血管系統(tǒng)疾病[1-3]、抑制腫瘤細胞增殖[4]、神經(jīng)保護作用[5-7]和保護肝臟作用[8-9]。對該類成分各種藥理機制的研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化作用是這類類胡蘿卜素產(chǎn)生各種藥理作用的基礎。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，梔子黃在4個體外抗氧化模型中顯示非常強的活性，而數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果又顯示強抗氧化活性與西紅花苷含量沒有相關(guān)性[10]。鑒于梔子黃顯示出較西紅花苷明顯更強的抗氧化活性，本課題進一步研究發(fā)現(xiàn)，梔子黃中除了西紅花苷外，以綠原酸為標準品測定到梔子黃中還含有相當量的多酚，為了揭示梔子黃的強抗氧化能力是否與多酚含量有關(guān)，我們進一步采用3個抗氧化能力測試模型結(jié)合HPLC和UV來評價梔子黃的抗氧化能力，從而為梔子黃中抗氧化成分提供線索。考慮到模型中亞鐵離子螯合實驗和還原能力實驗是前期沒有采用過的，本課題中也一并對比研究了梔子黃和西紅花苷-1的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二苯代苦味酰肼自由基（DPPH·）、Folin-Ciocalteu試劑（Fluca） 購自Sigma公司；實驗所用試劑 均為分析純；綠原酸對照品 中國藥品生物樣品檢定所，批號0749-9605。

UV-2550紫外分光光度系統(tǒng) 島津；自動雙重純水蒸餾器 上海申順生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗提物的制備 西紅花苷-1、西紅花苷-2、西紅花苷-3、梔子黃及梔子粗提物的提取和分離參見文獻[10-11]。

1.2.2 多酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu法測定[12]。取1mL不同濃度的樣品溶液加入試管中，依次加入去離子水1mL，福林-酚試劑0.5mL，26.7% Na2CO3溶液1.5mL，再加水6mL，在50℃水浴中反應5min，冷卻至室溫，在760nm下測定其吸光度，以綠原酸為對照品，求得試樣中總多酚的濃度。

1.2.3 西紅花總苷含量的測定 以西紅花苷-1、西紅花苷-2和西紅花苷-3為對照品，測定梔子黃中西紅花總苷的含量，HPLC方法參照文獻[10]。

1.2.4 DPPH自由基清除實驗 樣品DPPH自由基清除活性的測定方法參考文獻[13]。測定試劑為0.06mol/L的DPPH乙醇溶液，將0.5mL不同濃度的樣品液加入3.5mL的DPPH乙醇溶液中，室溫放置30min后測定517nm下的吸收度，利用下式轉(zhuǎn)化為抗氧化活性（AA）：

式中：A0是指不加樣品溶液的空白吸收度；A1指含有樣品的DPPH溶液的吸收度；As是指沒有DPPH，只有樣品溶液的吸收度，用于校正空白。

517nm處吸光度下降的幅度可以反映出樣品清除自由基能力的大小。計算每個樣品的EC50，實驗重復三次，結(jié)果取平均值。

1.2.5 還原力的測定 參照文獻[14]。將所有樣品溶解于去離子水中，稀釋成一定濃度的溶液，取2.5mL稀釋液，加入2.5mL 200mol/L的PBS（pH=6.6）和2.5mL 1%的K3Fe（CN）6，混合物在50℃恒溫放置20min，加入2.5mL 10%三氯乙酸，將混合物離心分離（200×g，10min）。取上清液5mL，加入5mL去離子水和1mL0.1% FeCl3，測定700nm處的吸光度，扣除空白。反應混合物的吸光度值越高，表明樣品的還原力越強。計算每個樣品的EC50，實驗重復三次，結(jié)果取平均值。

1.2.6 亞鐵離子螯合能力的測定 參照文獻[14]。將所有樣品溶解于去離子水中，稀釋成一定濃度的溶液，取稀釋液1.0mL，加入3.7mL甲醇和0.1mL三氯化鐵（2mmol/L）。反應由0.2mL ferrozine（5mmol/L）啟動，在室溫條件下靜置10min后，測定混合物在562nm處的吸光度。計算每個樣品的EC50，實驗重復三次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 梔子黃與粗提物多酚含量

課題采用綠原酸為對照品，使用UV-Visibl測定梔子粗提物和梔子黃的多酚含量，結(jié)果分別為7.03%和21.16%（圖1）。同時，采用HPLC分別測定西紅花總苷含量，含量分別為8.9%和44.9%。數(shù)據(jù)顯示，梔子黃中多酚和西紅花苷含量都明顯較梔子粗提物含量更高，說明HPD100大孔吸附樹脂能有效富集梔子黃中的西紅花苷和多酚。

圖1 梔子粗提物與梔子黃中多酚和西紅花苷的含量

2.2 還原能力的測定

圖2 還原能力測定結(jié)果

還原能力實驗在國內(nèi)外廣泛用作植物藥抗氧化能力評價的方法。本研究顯示，所有樣品在一定濃度范圍內(nèi)的還原性與它們的濃度成正比（圖2）。除了綠原酸，梔子黃顯示出所有樣品中的最強活性（EC50= 0.130mg/mL），而西紅花苷-1的活性相對較低（EC50= 0.180mg/mL），梔子粗提物顯示最弱還原能力（EC50= 0.390mg/mL）。將綠原酸EC50與每個樣品的EC50進行換算，即得各個樣品以綠原酸表示的活性強度（相當于綠原酸，mg/mg），將這些數(shù)據(jù)與多酚和西紅花總苷的濃度分別進行統(tǒng)計回歸，結(jié)果顯示，梔子粗提物和梔子黃還原能力與多酚濃度具有高相關(guān)性（圖3），相關(guān)系數(shù)為R=0.997，而兩份樣品的還原能力與西紅花苷濃度沒有顯示任何相關(guān)性（圖4）。實驗數(shù)據(jù)提示，梔子黃色素中起還原能力的主要化學成分是多酚類，而不是西紅花苷。我們前期研究也顯示[10]，在抗紅細胞溶血實驗、肝臟脂肪氧化抑制實驗以及鉬酸銨抗氧化活性實驗中,梔子黃都表現(xiàn)出較梔子粗提物顯著明顯的抗氧化活性，而這些活性都顯示出與其中西紅花苷濃度的低相關(guān)性，因此我們推測，梔子黃在這些模型中表現(xiàn)出的抗氧化活性也可能與其中的多酚濃度有相關(guān)性。

圖3 還原能力與多酚含量的相關(guān)性

圖4 還原能力與西紅花總苷的相關(guān)性

2.3 DPPH自由基清除活性的測定

DPPH自由基廣泛用來測試各種天然產(chǎn)物的抗自由基活性，當氫原子或者電子轉(zhuǎn)移到DPPH自由基時，樣品在517nm處褪色，顏色消褪的程度正比于自由基清除能力的大小。在這種模型中，具有高自由基清除能力的成分一般被認為具有高抗氧化活性。由于DPPH實驗操作簡單，重現(xiàn)性好，因此，該方法廣泛應用于從植物中尋找新的抗氧化成分[15]。

圖5 DPPH自由基清除實驗測定結(jié)果

在本課題清除DPPH自由基活性實驗中，所有的樣品都表現(xiàn)出量效關(guān)系（圖5）。綠原酸再一次顯示出最強活性（EC50=0.035mg/mL），顯著高于其它樣品。而梔子黃（EC50=0.170mg/mL）的活性也明顯強于西紅花苷-1（EC50=0.480mg/mL），梔子粗提物顯示最弱活性（EC50=0.620mg/mL）。同樣，將綠原酸EC50與每個樣品的EC50進行換算，即得各個樣品以綠原酸表示的活性強度（相當于綠原酸，mg/mg），將這些數(shù)據(jù)與多酚和西紅花總苷的濃度分別進行統(tǒng)計回歸，結(jié)果顯示，梔子粗提物和梔子黃還原能力與多酚濃度具有很高相關(guān)性（圖6），相關(guān)系數(shù)為R=1.0000，而兩份樣品的還原能力與西紅花苷濃度沒有顯示任何相關(guān)性（圖7）。實驗數(shù)據(jù)又一次顯示，梔子黃色素中起還原能力的主要化學成分是多酚類，而不是西紅花苷。

圖6 DPPH自由基清除能力與多酚的相關(guān)性

圖7 DPPH自由基清除能力與西紅花總苷的相關(guān)性

2.4 亞鐵離子螯合實驗

抗氧化活性的一個重要機制是螯合（鈍化）某些金屬離子，而后者可以催化氫過氧化物的降解以及Fenton類反應，從而達到抑制氧化的作用。因此，亞鐵離子螯合能力測定在天然產(chǎn)物抗氧化活性評價中具有非常重要的意義[16]。

本課題亞鐵離子螯合實驗見圖8，西紅花苷-1顯示很強活性（EC50=1.51mg/mL），而梔子黃（EC50=5.10mg/ mL）的活性較前者弱很多，但仍然強于梔子粗提物（EC50=41.34mg/mL）。在這個模型中，經(jīng)過富集的梔子黃表現(xiàn)出較梔子粗提物明顯更強的活性。同樣，將綠原酸EC50與每個樣品的EC50進行換算，即得各個樣品以綠原酸表示的活性強度（相當于綠原酸，mg/mg），將這些數(shù)據(jù)與多酚和西紅花總苷的濃度分別進行統(tǒng)計回歸，結(jié)果顯示，梔子粗提物和梔子黃螯合能力與多酚濃度和西紅花苷都具有高相關(guān)性（圖9、圖10），相關(guān)系數(shù)分別為0.996和0.982。實驗數(shù)據(jù)顯示，與前兩個模型不同，西紅花苷和多酚類成分都具有明顯的螯合活性，梔子黃中具有螯合活性的主要化學成分同時包括西紅花苷和多酚類。

圖8 螯合實驗測定結(jié)果

圖9 螯合能力與多酚的相關(guān)性

圖10 螯合能力與西紅花總苷的相關(guān)性

3 結(jié)論

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，梔子黃強抗氧化活性與西紅花苷含量沒有相關(guān)性。而本課題的研究數(shù)據(jù)顯示，在還原能力和DPPH自由基清除活性模型中，梔子黃色素中起抗氧化作用的主要化學成分是多酚類，而不是西紅花苷；另一方面，與前兩個模型不同，西紅花苷和多酚類成分都具有明顯的亞鐵離子螯合活性，梔子黃中具有螯合活性的主要化學成分同時包括西紅花苷和多酚類。結(jié)合前期研究結(jié)果推測，梔子黃抗氧化作用的主要化學成分是多酚類，而西紅花苷具有明顯的亞鐵離子螯合活性。

[1]HeSYQianZY,TangFT,etal.Effectofcrocinonexperimental atherosclerosis in quails and its mechanisms[J].Life Sci,2005,77：907-921.

[2]Shen X C,Qian Z Y.Effects of crocetin on antioxidant enzymatic activities in cardiac hypertrophy induced by norepinephrine in rats [J].Pharmazie,2006,61:348-352.

[3]Xiang M,Qian Z Y,Zhou C H,et al.Crocetin inhibits leukocyte adherence to vascular endothelial cells induced by AGEs[J].J Ethnopharmacol,2006,107：25-31.

[4]Venkatraman M,Jayapal P V S,Karupaya S,et al.Antitumour activity of crocetin in accordance to tumor incidence,antioxidant status,drug metabolizing enzymes and histopathological studies [J].Mol Cell Biochem,2006,287：127-135.

[5]Takashi O,Shigekazu O,Shinji S,et al.Crocin prevents the death of rat pheochromyctoma(PC-12)cells by its antioxidant effects stronger than those of α-tocopherol[J].Neurosci Lett,2004,362：61-64.

[6]Takashi O,Shinji S,Shigekazu O,et al.Crocin prevents the death of PC-12 cells through sphingomyelinase-ceramide signaling by increasing glutathione synthesis[J].Neurochem Int,2004,44：321-330.

[7]AbdullahSA,MubeenAA,MuzamilA,etal.Neuroprotection by crocetin in a hemi-parkinsonian rat model[J].Pharmacol Biochem Be,2005,81：805-813.

[8]Wang C J,Shiow S J,Lin J K.Effects of crocetin on the hepatotoxicity and hepatic DNA binding of aflatoxin B1 in rats [J].Carcinogenesis,1991,12：459-462.

[9]Tseng T H,Chu C Y,Huang J M,et al.Crocetin protects against oxidative damage in rat primary hepatocytes[J].Cancer Lett,1995, 97：61-67.

[10]Yang C,Hao Z,Xi T,et al.Antioxidant potential of crocins and ethanol extracts of Gardenia jasminoides ELLIS and Crocus sativus L.:A relationship investigation between antioxidant activity and crocin contents[J].Food Chemistry,2008,109(3)：484-492.

[11]Yang C,Le C,Can Z,et al.Spectroscopic,stability and antioxidant properties of a novel pigment from Gardenia[J].Food Chemistry,2008,109：269-277.

[12]Robert Yawadio Nsimba,Hiroe Kikuzaki,Yotaro Konishi. Antioxidantactivity ofvarious extracts and fractions of Chenopodium quinoa and Amaranthus spp.Seeds[J].Food Chemistry,2008,106:760-766.

[13]Leong L P,Shui G.An investigation of antioxidant capacity of fruits in Singapore markets[J].J Agr Food Chem,2002,76：69-75.

[14]Haiyan Wang,Mouming Zhao,Bao Yang,et al.Identification ofpolyphenolsintobaccoleafandtheirantioxidantandantimicrobial activities[J].Food Chemistry,2008,107:1399-1406.

[15]Lee J M,Chung H,Chang P S,et al.Development of a method predicting the oxidative stability of edible oils using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)[J].J Agr Food Chem,2007, 103:662-669.

[16]Rajesh Manian,Nagarajan Anusuya,Perumal Siddhuraju,et al.The antioxidant activity and free radical scavenging potential of two different solvent extracts of Camellia sinensis (L.)O. Kuntz,Ficus bengalensis L.and Ficus racemosa L [J].Food Chemistry,2008,107:1000-1007.

Study on relationship between polyphenols content and antioxidant effect of gardenia yellow

CHEN Yang1，ZHANG Hao2，WANG Wen-jun1，XIANG Can-hui1，HE Xiao-tong1，CAI Le3，*
（1.Department of Chemistry,Zunyi Medical College Zhuhai Campus,Zhuhai 519041,China；2.West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China；3.Key Laboratory of Medicinal Chemistry for Nature Resource,Ministry of Education,School of Chemical Science and Technology,Yunnan University,Kunming 650091,China）

Objective:In order to investigate the relationship between polyphenols content and antioxidant effect of gardenia yellow.Methods:Reducing power assay，DPPH radical scavenging effect and chelating ability on ferrous ions were determined.Then，with the aid of HPLC and UV，crocins and polyphenols content were measured.Results:In terms of reducing power assay and DPPH radical scavenging assay，only polyphenols content showed relationship with antioxidant effect of gardenia yellow.In addition，crocins and polyphenols contents can significantly chelate ferrous ions，and therefore，were responsible for the chelating power of gardenia yellow.Conclusion:Current data，as well as those obtained previously，indicate chemicals which feature considerabe antioxidant effect in gardenia yellow were polyphenols.However，in all models，crocins show significant antioxidant only in chelating ability on ferrous ions.

gardenia yellow；crocins；polyphenols；antioxidant；UV；HPLC

TS201.2

A

1002-0306（2011）10-0125-04

2010-07-29 *通訊聯(lián)系人

陳陽（1977-），男，博士，副教授，研究方向：中藥有效成分的提取、分離及分析。

貴州省高層次人才特助基金（2010）；貴州省國際合作項目基金（2009GZ52794）。