3D-人造皮膚模型在化妝品安全性、功效性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

張春曉+杜鎮(zhèn)建+張興民

人類皮膚覆蓋于整個(gè)體表，被稱為生命之裳，不僅因?yàn)槠つw保護(hù)我們的肌肉和內(nèi)臟免受環(huán)境中有害物質(zhì)的侵害，還源于它的重要審美價(jià)值。人類追尋美麗的步伐從未停止過，《齊民要術(shù)》里就有各種關(guān)于如何配制護(hù)膚品的記載。進(jìn)入21世紀(jì)，隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高，化妝品已經(jīng)成為人們的生活必需品。如何保障化妝品的安全性和功效性，是政府監(jiān)管部門、化妝品公司和消費(fèi)者共同關(guān)注的問題。

在過去的三十年，化妝品的安全性檢測(cè)主要依靠動(dòng)物試驗(yàn)，然而動(dòng)物試驗(yàn)遭到動(dòng)物保護(hù)組織的強(qiáng)烈反對(duì)。歐盟自2013年起，全面禁止出售和進(jìn)口基于動(dòng)物試驗(yàn)的化妝品或原料。化妝品的功效性檢測(cè)一般是通過體外細(xì)胞試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)，不過鑒于人體皮膚組織的復(fù)雜性，簡(jiǎn)單的體外細(xì)胞模型很難反應(yīng)真實(shí)情況。

3D-人造皮膚模型為化妝品安全性、功效性評(píng)價(jià)提供了新的技術(shù)手段。3D-人造皮膚模型是將人的正常皮膚細(xì)胞培養(yǎng)于特殊的插入式培養(yǎng)皿上，得到具有三維結(jié)構(gòu)的皮膚組織模型。如圖1，其表面形成角質(zhì)層暴露于空氣中，可以將受試化妝品直接滴加在表面，模擬了將化妝品涂抹于局部皮膚表面的過程；基層細(xì)胞依靠底部培養(yǎng)基維持生長(zhǎng)。3D-人造皮膚模型因?yàn)槠浣M織結(jié)構(gòu)和生理功能與正常皮膚組織十分相似，而成為良好的皮膚替代模型，并且在近年來被廣泛應(yīng)用。目前商品化的3D-人造皮膚模型可以分為3類：表皮模型、全皮模型和黑色素皮膚模型。本文針對(duì)這3種模型，簡(jiǎn)單介紹它們?cè)诨瘖y品安全性和功效性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

1 表皮模型

表皮模型顧名思義，與人類的表皮結(jié)構(gòu)相似，僅由角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，包括基底細(xì)胞層、棘細(xì)胞層、顆粒層和角質(zhì)層。使用表皮模型替代動(dòng)物試驗(yàn)，進(jìn)行化妝品及其原料的腐蝕性、刺激性檢驗(yàn)，已經(jīng)得到歐洲替代方法研究中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）的認(rèn)可，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development， OECD）也頒布了相應(yīng)的試驗(yàn)指南（OECD Testing Guideline 431&439）。另外，ECVAM正在審批使用表皮模型進(jìn)行皮膚光毒性檢測(cè)。

1.1 皮膚腐蝕性、刺激性檢測(cè)

檢測(cè)化妝品的皮膚毒性是安全性評(píng)價(jià)中的重要組成部分。將表皮模型用于皮膚腐蝕性、刺激性檢測(cè)，能很好地模擬化妝品滲透皮膚進(jìn)入機(jī)體進(jìn)而產(chǎn)生毒性的過程，而且操作簡(jiǎn)便，只需將受試品滴加于模型表面，孵育相應(yīng)時(shí)間，再使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活率，即可將腐蝕性、刺激性這類描述性詞語，轉(zhuǎn)換為具體的數(shù)據(jù)進(jìn)行判斷。不僅保證了動(dòng)物福利，而且過程更簡(jiǎn)捷，結(jié)果更準(zhǔn)確。

1.2 皮膚光毒性檢測(cè)

光毒性是指皮膚接觸化學(xué)物質(zhì)后，再與紫外線接觸而產(chǎn)生的皮膚毒性反應(yīng)。很多特殊用途化妝品，比如防曬霜，燙發(fā)、染發(fā)產(chǎn)品，它們的原料中都可能含有可產(chǎn)生光毒性的化學(xué)物質(zhì)。使用表皮模型進(jìn)行光毒性檢測(cè)，其過程是先將受檢物滴加于模型表面，然后暴露于一定照射劑量（通常為1.7 mW/cm2）的紫外線下一個(gè)小時(shí)，再使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活率。

2 全皮模型

人類皮膚包括表皮、真皮和皮下組織三個(gè)部分。真皮層含有成纖維細(xì)胞和膠原纖維，成纖維細(xì)胞與表皮中的角質(zhì)細(xì)胞相互作用，促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞分裂、分化；膠原纖維為皮膚提供彈性。全皮模型包括表皮與真皮兩部分，表皮部分與表皮模型相似，真皮部分是由成纖維細(xì)胞和膠原基質(zhì)組成。全皮模型在結(jié)構(gòu)上與皮膚更相似，適合進(jìn)行抗衰老、保濕等化妝品功效性研究。

2.1 抗衰老

抗衰老是國(guó)內(nèi)外化妝品功效研究的熱門課題。衰老的明顯特征為皺紋產(chǎn)生和皮膚松弛，表現(xiàn)為表皮真皮連接處變平、彈性纖維和膠原纖維減少等情況。人類全基因組表達(dá)譜繪制的完成，幫助研究者鑒別出在皮膚老化過程中起關(guān)鍵作用的因子，如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和炎癥介質(zhì)等。使用全皮模型做為抗衰老評(píng)價(jià)的體外模型，其優(yōu)勢(shì)有兩個(gè)：第一，全皮模型具有角質(zhì)層，可以將化妝品涂抹在上面，模擬化妝品作用于皮膚局部的過程；第二，全皮模型具有活的角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，其生理功能與真實(shí)皮膚組織中的細(xì)胞相似，因此可以檢測(cè)抗衰老關(guān)鍵基因、蛋白的表達(dá)情況，從分子生物學(xué)角度評(píng)價(jià)化妝品的功效。

2.2 保濕作用

保濕是指通過使用相應(yīng)化妝品維持肌膚，尤其是面部肌膚的含水量。保濕對(duì)于皮膚而言非常重要，因?yàn)槠つw與空氣直接接觸，水分非常容易流失。研究者發(fā)現(xiàn)人體皮膚中存在許多具有保濕作用的因子。如果在皮膚表面添加這些保濕因子，是否可以起到保濕作用呢？全皮模型為證明研究者的假設(shè)提供了有效的技術(shù)手段。

以透明質(zhì)酸為例，研究者發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸在表皮中負(fù)責(zé)保持皮膚的水分和彈性。隨著年齡的增長(zhǎng)，表皮中的透明質(zhì)酸含量逐漸降低，進(jìn)而皮膚平整度降低皺紋產(chǎn)生。N-乙酰-葡萄糖胺是透明質(zhì)酸的前體物質(zhì)，煙酰胺是透明質(zhì)酸合成的重要協(xié)同因子。研究者將N-乙酰-葡萄糖胺和煙酰胺加至全皮模型表面一段時(shí)間后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸和膠原蛋白的基因表達(dá)與蛋白表達(dá)量均有上升，說明在皮膚表面施加N-乙酰-葡萄糖胺和煙酰胺，對(duì)于透明質(zhì)酸的合成有促進(jìn)作用。

3 黑色素皮膚模型

黑色素是人體皮膚的關(guān)鍵色素，主要功能是清除紫外線輻射給皮膚帶來的傷害，但同時(shí)也帶來膚色變暗、色斑生成等皮膚問題。皮膚美白是指通過使用特殊的化妝品抑制由紫外線照射所生成的黑色素，防止色斑的產(chǎn)生，恢復(fù)皮膚原本的色澤。這些化妝品中通常含有黑色素生成抑制劑，它們作用于黑色素形成的不同階段，比如抑制黑色素細(xì)胞被紫外線激活，抑制酪氨酸酶活性或是抑制黑素體轉(zhuǎn)移黑色素至角質(zhì)細(xì)胞。無論是以何種原理或方式抑制黑色素生成，最終評(píng)價(jià)黑色素抑制劑是否有效，都需要測(cè)量黑色素含量。

黑色素由位于表皮基底層的黑色素細(xì)胞分泌。黑色素皮膚模型是在表皮模型的基礎(chǔ)上，添加正常人類黑色素細(xì)胞。這些黑色素細(xì)胞同樣位于表皮基底層，能夠自發(fā)地產(chǎn)生黑色素，然后通過黑素體傳遞給相鄰的角質(zhì)細(xì)胞。因此可以利用黑色素模型評(píng)價(jià)化妝品對(duì)于黑色素的調(diào)節(jié)作用。

小結(jié)

傳統(tǒng)的化妝品安全性，采用動(dòng)物試驗(yàn)，例如向兔子的角膜滴加受試品，檢測(cè)其刺激性。不僅結(jié)果不準(zhǔn)確—因?yàn)橥米拥慕悄づc人類皮膚有很大的差別，而且十分殘忍，不符合動(dòng)物福利。

化妝品功效性試驗(yàn)，多是采用體外細(xì)胞培養(yǎng)，比如使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T3）檢測(cè)光毒性，或是使用小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16）檢測(cè)黑色素抑制作用。這些體外試驗(yàn)雖然可以提供一些有幫助的數(shù)據(jù)，但也都存在很多問題。首先，它們均使用小鼠或其他動(dòng)物的細(xì)胞，甚至于腫瘤細(xì)胞，與人正常表皮細(xì)胞的生理功能相差甚遠(yuǎn)；其次，這些體外試驗(yàn)的細(xì)胞均是浸沒于培養(yǎng)基

中，實(shí)際上人類皮膚是暴露于空氣中，因此將化妝品加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，與將它們涂抹于皮膚表面之間存在明顯的差異；再次，化妝品的功效性評(píng)價(jià)一直存在主觀性過強(qiáng)的問題，因?yàn)橄癜櫦y數(shù)量是否減少，皮膚含水量是否增多，皮膚是否變白，都是依靠人的肉眼觀察，然后進(jìn)行判斷，這樣難免會(huì)見仁見智，出現(xiàn)偏差。

3D-人造皮膚模型利用特殊的氣液面培養(yǎng)方式，得到具有角質(zhì)層的多層細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，既可以模擬化妝品加于皮膚上的真實(shí)狀況，又可以將主觀判定的功效轉(zhuǎn)變?yōu)榫唧w數(shù)據(jù)輸出，為化妝品功效性評(píng)價(jià)提供一個(gè)更加客觀、科學(xué)和準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)模型。endprint