正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化甲氨蝶呤囊泡的制備＊

張 波 王啟平 王慧云 全先高 王盈盈 王 寧

（1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧272067；2濟(jì)寧任城區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所，濟(jì)寧272100；3濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 日照276826）

非離子表面活性劑囊泡（noisome，以下簡稱囊泡），是由非離子表面活性劑和膽固醇構(gòu)成的新型藥物載體，其結(jié)構(gòu)組成與脂質(zhì)體相似，具有單層或多層結(jié)構(gòu)，而且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能降低藥物的毒副作用，提高藥物治療效果，是一種很有發(fā)展前途的新型給藥系統(tǒng)［1－3］。甲氨蝶呤（MTX）是常見的抗腫瘤化療藥物，但其毒副作用較大，有嚴(yán)重的肝、腎損害，骨髓抑制，腸道反應(yīng)等。為提高甲氨蝶呤的抗癌療效，降低其毒副作用，國內(nèi)外學(xué)者已做了許多研究工作。如制備甲氨蝶呤脂質(zhì)體、磁導(dǎo)向甲氨蝶呤緩釋藥物、甲氨蝶呤淀粉納米粒等［4－6］。本文采用非離子表面活性劑和膽固醇作為包封甲氨蝶呤的膜材，選用L9（34）因素水平表，對甲氨蝶呤囊泡的制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳制備方案。報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器

UV－2600紫外可見分光光度計(jì)（島津公司）；RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海嘉鵬科技有限公司）；PHSJ－4A酸度計(jì)（上海元析儀器有限公司 ）；KQ－600GDV醫(yī)用超聲波清洗器（河南鞏義予華儀器有限公司）；透析袋（北京索萊寶科技有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1．2 試劑

甲氨蝶呤（中國藥品生物制品檢定所）；司盤（Span）20、40、60、80（天津凱通化學(xué)試劑有限公司，均為分析純）；膽固醇（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；三氯甲烷（分析純，國藥集團(tuán)試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，國藥集團(tuán)試劑有限公司）；其它試劑均為分析純。

1．3 貯備液

配制一系列Span40濃度分別為0．10、0．12、0．14mol／L的溶液，以 VCHCl3∶VC2H5OH＝4∶1的混合溶劑配制。

0．10mol／L膽固醇溶液的配制 取9．67g膽固醇溶于上述混合溶劑中，再加混合溶劑定容至250ml。

PBS緩沖溶液的配制800ml去離子水中溶解8．0g NaCl、0．20g KCl、1．44g Na2HPO4、0．42g KH2PO4，用NaOH溶液調(diào)pH至7．4，再加水定容至1000ml。

1．4 實(shí)驗(yàn)方法

1．4．1 囊泡的制備 分別取0．10mol／L 20、40、60、80和0．10mol／L膽固醇4．0ml加入至100ml圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40～50℃水浴真空旋轉(zhuǎn)蒸干有機(jī)溶劑，再加入5．0ml一定濃度的甲氨蝶呤溶液或5．0ml蒸餾水，超聲40min，即制得載藥囊泡或空白囊泡。

以Span40濃度、Span40和膽固醇的比例、藥物濃度、超聲時(shí)間為考察因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)選，以包封率為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。見表1。

表1 L9（34）因素和水平

1．4．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取5．0mg甲氨蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品溶于0．01mol／L的氫氧化鈉溶液中，轉(zhuǎn)置于50ml容量瓶中，用0．01mol／L的氫氧化鈉溶液定容。分別取上述溶液2．0、4．0、6．0、8．0、10．0ml，置于50ml容量瓶中，用0．01mol／L的氫氧化鈉溶液定容，得其濃度分別為4、8、12、16、20μg／ml。以0．01mol／L的氫氧化鈉溶液作空白對照，在303nm處測定其吸光度。見圖1。

由圖1可見，在測定濃度范圍內(nèi)，甲氨蝶呤溶液的濃度C（μg／ml）與吸光度A之間存在良好的線性關(guān)系，其回歸方程為：Y＝0．05397C－0．00307，R＝0．9999。

圖1 甲氨蝶呤標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1．4．3 包封率的測定 取2ml空白囊泡或載藥囊泡溶液于透析袋中，在100ml pH＝7．4的PBS緩沖液中透析24h，取一定量的透析液，用紫外分光光度計(jì)測定其在303nm處的吸光度，扣除空白囊泡的吸收，即可算得包封率［4］。

2 結(jié)果與討論

2．1 影響甲氨蝶呤囊泡包封率的研究

2．1．1 表面活性劑的影響 分別采用20、40、60、80制備甲氨蝶呤囊泡，考察不同表面活性劑對包封率的影響，其結(jié)果見圖2。由Span40和膽固醇構(gòu)成的囊泡對甲氨蝶呤的包封效果較好。見圖2。

圖2 Span種類對包封率的影響

2．1．2 Span40濃度的影響 分別采用不同濃度的Span40溶液，考察表面活性劑濃度對甲氨蝶呤囊泡包封率的影響。見表2。

表2 Span40濃度對包封率的影響

由表2可知，當(dāng)Span40濃度為0．12mol／L時(shí)包封率最高。原因是在制備囊泡的過程中加入膽固醇一般可提高膜的穩(wěn)定性，降低藥物的通透性，提高包封率與載藥量。膽固醇具有填充效應(yīng)，它能填充在表面活性劑單體形成的分子空隙中，賦予雙層膜一定的剛性［7］。

2．1．3 膽固醇用量的影響 固定Span40用量，改變膽固醇與Span40的比例來考察膽固醇用量對甲氨蝶呤囊泡包封率的影響（見表3）。由表3可知，當(dāng)Span40∶CHOL＝4∶2時(shí)，包封效率較高。比例繼續(xù)增加，包封率反而下降。原因是膽固醇是助表面活性劑，可以增加雙分子層中脂質(zhì)分子排列的緊密程度，起到穩(wěn)定類脂質(zhì)體的作用，有利于囊泡的形成，但過多的膽固醇分子插入雙層膜增加了雙分子層的不對稱性，使藥物泄漏概率增加，包封率反而下降［8］。

表3 膽固醇用量對包封率的影響

2．1．4 藥物濃度的影響 改變加入甲氨蝶呤溶液的濃度，考察藥物濃度對甲氨蝶呤囊泡包封率的影響。見表4。

表4 藥物濃度對包封率的影響

由表4可知，當(dāng)藥物濃度在0．6g／L時(shí)，藥物包封率達(dá)到最高。濃度較低時(shí)包封率隨甲氨蝶呤濃度增加而上升，說明囊泡的包封容量是有限的。

2．1．5 超聲時(shí)間的影響 固定其他制備條件，改變超聲時(shí)間，考察超聲時(shí)間對甲氨蝶呤包封率的影響。見表5。

表5 超聲時(shí)間對包封率的影響

由表5可知，超聲時(shí)間在40min時(shí)包封率較高。超聲有利于藥物的包封，但超聲時(shí)間過長會打碎一些比較大的多室囊泡，使得包容藥物的體積減小，同時(shí)囊泡打碎的過程中也有一些藥物釋放出來，造成包封率下降。

2．2 甲氨蝶呤囊泡制備最佳工藝確定

正交實(shí)驗(yàn)見表6，方差分析見表7。

表6 正交設(shè)計(jì)及結(jié)果

表7 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由表6可知，4個(gè)因素的級差大小順序?yàn)镈＞B＞C＞A，其中超聲時(shí)間對甲氨蝶呤囊泡制備工藝影響最大，膽固醇用量影響較大，藥物濃度和Span40濃度影響最小，由表6可見因素B（膽固醇用量）和因素D（超聲時(shí)間）有顯著性，因素 A（Span40濃度）和因素C（藥物濃度）無顯著性。即囊泡制備的最佳工藝條件為A2B2C2D2，即當(dāng)司盤40濃度為0．12mol／L，司盤40∶CHOL為4∶2，藥物濃度為0．6g／L，超聲時(shí)間為40min時(shí)，藥物的包封率達(dá)到最高。

2．3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選的最佳工藝進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得出甲氨蝶呤囊泡的平均包封率為62．09%。

3 結(jié)論

本文以司盤類非離子表面活性劑和膽固醇為主要原料，采用薄膜分散法制備甲氨蝶呤類脂囊泡，以包封率作為考察指標(biāo)，通過L9（34）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了甲氨蝶呤囊泡的制備工藝條件，確定了較優(yōu)處方，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示優(yōu)選得到的最佳制備工藝條件是可行的，為新型藥物傳輸系統(tǒng)的研究提供一定的依據(jù)，適合進(jìn)一步研究。

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