1H NMR檢測(cè)技術(shù)結(jié)合PCA及OPLS在SLE疾病發(fā)生、發(fā)展中的應(yīng)用研究

彭華明 王悅寧 王艷梅

1H NMR檢測(cè)技術(shù)結(jié)合PCA及OPLS在SLE疾病發(fā)生、發(fā)展中的應(yīng)用研究

彭華明 王悅寧 王艷梅

目的 了解1H NMR檢測(cè)技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別技術(shù)-主成分分析法（PCA）及正交偏最小二乘法方法(OPLS)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）疾病發(fā)生、發(fā)展中的應(yīng)用價(jià)值。方法 采用瑞士Bruker 600MHzNMR譜儀，對(duì)34例健康志愿者（對(duì)照組）與62例SLE患者（觀察組）血清樣本進(jìn)行檢查，基于把握代謝物差異基礎(chǔ)上取代謝物指紋圖譜，綜合模式識(shí)別分析方法，建立SLE診斷模型。結(jié)果 SLE對(duì)氨基酸、脂類、能量代謝具有影響作用。PCA可對(duì)觀察組與對(duì)照組進(jìn)行區(qū)分，PLS-DA模型預(yù)測(cè)率達(dá)0.393，OPLS-DA模型診斷特異性達(dá)97.1%左右，敏感性達(dá)60.9%左右。結(jié)論 利用1H NMR檢測(cè)技術(shù)及PCA及OPLS，強(qiáng)化SLE疾病監(jiān)測(cè)，能夠指導(dǎo)臨床治療，改善患者預(yù)后。

1H NMR檢測(cè)技術(shù)；PCA；OPLS；SLE疾病

SLE作為臨床上一種常見的自身免疫性疾病，多表現(xiàn)為免疫性炎癥，易波及多器官、多系統(tǒng)，目前病因尚未完全清晰，根治療法欠缺[1]。近年來，伴隨著基因組技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用微陣列技術(shù)對(duì)SLE外周血基因表達(dá)譜進(jìn)行研究，篩選SLE有關(guān)基因，證實(shí)臨床免疫表型譜與SLE基因表達(dá)譜具有關(guān)聯(lián)性[2]。本研究選取健康志愿者與SLE患者外周血清樣本中的內(nèi)源性代謝物，立足于機(jī)體病理變化角度，綜合1H NMR檢測(cè)技術(shù)及 PCA與OPLS等分析方法，探究SLE疾病發(fā)生、發(fā)展過程，旨在分析代謝組學(xué)在SLE發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用價(jià)值。相關(guān)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇坪山新區(qū)人民醫(yī)院于2012年3月～2014年3月收治的62例SLE患者為觀察組，與1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)制定的SLE臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)吻合，其中男12例，女50例，年齡22～65歲，平均(45.67±4.78)歲。另擇取同期來體檢的

34例健康志愿者為對(duì)照組，男9例，女25例，年齡21～68歲，平均(47.78±3.05)歲。2組患者年齡、性別等一般資料對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 采集標(biāo)本方法 嚴(yán)格執(zhí)行規(guī)范程序，于清晨抽取外周靜脈血3mL，置入生化管內(nèi)，待靜置0.5h后，采用3000r/ min的速度離心10min后留取500μL上清液，置入冰箱（-80℃）內(nèi)保存。

1.2.2 檢測(cè)方法 待室溫凍融標(biāo)本后留取血清200μL溶于重水200μL中。將核磁管（5mm）置入混合液中，在瑞士Bruker 600MHzNMR譜儀上進(jìn)行樣本一維及二維氫譜，開展維水峰抑制實(shí)驗(yàn)，擇取標(biāo)準(zhǔn)預(yù)飽，并選擇壓水NOESY1DPR序列，RD（弛豫延遲）設(shè)置為2.5s，tm（混合時(shí)間）設(shè)置為100ms，累記次數(shù)達(dá)128次，對(duì)RD與tm進(jìn)行對(duì)水處理，做好飽和照射。采集時(shí)間約0.95s，溫度維持25℃，譜寬達(dá)8384Hz。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用TopSpin軟件傅立葉變換譜圖，并進(jìn)行相位調(diào)整、定標(biāo)處理等，同時(shí)對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定與量化處理，建立指紋圖譜，采用模式識(shí)別分析法構(gòu)建并驗(yàn)證LN與SLE診斷模型。

2 結(jié)果

2.11H NMR圖譜分析 經(jīng)由檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，觀察組譜圖與對(duì)照組譜圖具有相似點(diǎn)，其差異信號(hào)主要為氨基酸與脂肪區(qū)域，其中關(guān)鍵差異代謝物源于某些脂質(zhì)代謝片段，包括L10、L9、L8、L7、L6。而高密度脂蛋白、磷酸膽堿、膽固醇水平出現(xiàn)下降，極低密度脂蛋白（包括L5、L3）與低密度脂蛋白（包括L2、L4）水平呈上升態(tài)勢(shì)，生糖氨基酸（包括谷氨酸、纈氨酸、酪氨酸、丙氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸）及生酮水平呈下降趨勢(shì)，其他代謝物（包括肌氨酸酐、丙酮酸、檸檬酸、甲酸、谷氨酸鹽、肌酸）信號(hào)衰退。

2.2 PR變化分析 依據(jù)PCA分析結(jié)果，構(gòu)建PC1與PC2得分圖，其中PC1占總變量的76.6%，PC2占總變量的10.9%，區(qū)分觀察組與對(duì)照組，獲取PLS-DA模型得分圖，經(jīng)由排序驗(yàn)證（200次）獲取最終驗(yàn)證圖。結(jié)合OPLS-DA診斷模型得分圖，可觀察組間的差異性，其對(duì)疾病的敏感性為60.9%左右，特異性達(dá)97.1%左右。

3 討論

隨著醫(yī)療水平的不斷發(fā)展，代謝組學(xué)技術(shù)在臨床研究上得到廣泛推廣，多以NMR為依據(jù)，綜合模式識(shí)別分析方法，建立機(jī)體代謝指紋圖譜，可對(duì)疾病病理狀態(tài)進(jìn)行詳細(xì)區(qū)分，與單一標(biāo)志物相比較，其對(duì)疾病診斷更具有應(yīng)用價(jià)值[3]。

本研究以SLE患者為研究對(duì)象，通過構(gòu)建血清代謝物指紋圖譜，深入探究疾病診斷方法，依據(jù)NOESY1DPR譜圖可得，SLE患者與正常人群血清代謝物差異多表現(xiàn)在氨基酸與脂質(zhì)區(qū)域。針對(duì)脂質(zhì)區(qū)域而言，HDL出現(xiàn)下降現(xiàn)象，且VLDL、LDL呈上升態(tài)勢(shì)，與以往研究具有一致性，充分表明SLE極其容易誘發(fā)脂質(zhì)代謝失衡。一般而言，針對(duì)SLE患者而言，其血清氨基酸水平出現(xiàn)下降現(xiàn)象，其中涵蓋生酮（氨基酸）、生糖、檸檬酸（三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物）均呈下降態(tài)勢(shì)，同時(shí)丙酮酸（糖酵解中間產(chǎn)物）亦減少，表明SLE患者能量代謝處于失衡狀態(tài)。究其根源，可能由于增強(qiáng)蛋白質(zhì)分解代謝后，基于炎癥狀態(tài)下，導(dǎo)致能量需求上升[4-6]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道指出，針對(duì)SLE與RA患者而言，其血清中的組氨酸水平與正常人比較，呈下降態(tài)勢(shì)[7-9]。由此可見，以往單一代謝物無法成為SLE特異標(biāo)志物，基于把握代謝物改變信息基礎(chǔ)上，才能對(duì)SLE患者疾病狀態(tài)進(jìn)行區(qū)分。

本研究結(jié)合模式識(shí)別分析方法，對(duì)收集的代謝物信息進(jìn)行綜合判斷后經(jīng)由PCA得分圖提示，正常人群與SLE患者區(qū)分明顯，表明在血清代謝物輪廓上，健康人群與SLE患者差異顯著。而結(jié)合PLS-DA得分圖對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，模型預(yù)測(cè)率為0.393，充分證實(shí)這一結(jié)論的準(zhǔn)確性。為了避免非實(shí)驗(yàn)因素對(duì)其形成干擾，故對(duì)PLS-DA得分圖進(jìn)行正交濾噪處理，獲取OPLS-DA得分圖，可對(duì)健康人群與SLE患者進(jìn)行最優(yōu)化區(qū)分，凸顯2組差異性，模型驗(yàn)證特異性與敏感性較高[10]。本研究結(jié)果提示，綜合血清差異代謝物建立診斷模型，可對(duì)健康人群與SLE患者進(jìn)行區(qū)分，得分圖提示代表健康人群的點(diǎn)處于集中狀態(tài)，而SLE組呈離散狀態(tài)，可能由于SLE出現(xiàn)活動(dòng)期與緩解期，加上易誘發(fā)系統(tǒng)并發(fā)癥，故表現(xiàn)于此，有待后續(xù)強(qiáng)化驗(yàn)證[11]。

整體上來講，綜合代謝組學(xué)技術(shù)分析SLE患者外周血清標(biāo)本，可區(qū)分正常人與SLE患者血清的代謝輪廓。結(jié)合模式識(shí)別分析方法，強(qiáng)化海量數(shù)據(jù)綜合分析，可對(duì)正常人與SLE患者進(jìn)行區(qū)分，從而構(gòu)建敏感性與特異性均高的診斷模型，表明代謝組學(xué)已成為了一種全新的SLE診斷方法，可研究SLE發(fā)病機(jī)制，補(bǔ)充基因與轉(zhuǎn)錄組成果[12]。

綜上所述，1H NMR檢測(cè)技術(shù)結(jié)合PCA及OPLS在SLE發(fā)病機(jī)制研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，值得臨床推廣與應(yīng)用。

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doi∶10.3969/j.issn.1009-4393.2015.13.028

廣東 518118 廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科 （彭華明 王悅寧） 518000 廣東省深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院ICU （王艷梅）