白介素33下調(diào)高遷移率族蛋白1保護(hù)大鼠缺血再灌注心肌的研究

馬瑞松，江 洪，李元紅，胡笑容，李雪飛

基礎(chǔ)研究

·論著·

白介素33下調(diào)高遷移率族蛋白1保護(hù)大鼠缺血再灌注心肌的研究

馬瑞松，江 洪，李元紅，胡笑容，李雪飛

目的 探討白介素33(IL-33)是否可以通過(guò)調(diào)控高遷移率族蛋白1(HMGB1)表達(dá)保護(hù)大鼠缺血再灌注(I/R)心肌。方法 將32只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)(SO)組(n=10)、I/R模型組(n=10)、IL-33組(n=6)、HMGB1抗體(HMGB1 Ab)組(n=6)。SO組大鼠開(kāi)胸，左前降支(LAD)下穿線，但不結(jié)扎;其余3組制作大鼠I/R模型，IL-33組于造模前30 min予尾靜脈注射IL-33 10 μg，HMGB1 Ab組于造模前30 min予尾靜脈注射IL-33 10 μg及HMGB1中和抗體。檢測(cè)各組血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)水平，心肌組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、HMGB1、總半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、活化Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)，定量檢測(cè)SO組、I/R組、IL-33組心肌組織中HMGB1 mRNA。結(jié)果 再灌注4 h后，IL-33可明顯降低I/R大鼠血清LDH、CK水平，降低心肌組織TNF-α、IL-6、HMGB1、Bax的表達(dá)和Caspase-3活化(P<0.05)，升高Bcl-2表達(dá)(P<0.05)；HMGB1可減弱IL-33的上述作用(P<0.05)。結(jié)論 IL-33可通過(guò)抑制心肌組織中HMGB1表達(dá)進(jìn)而抑制心肌炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，保護(hù)I/R心肌。

心肌再灌注損傷;白介素33;高遷移率族蛋白1；大鼠,Sprague-Dawley

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注(ischemia and reperfusion, I/R)損傷的一個(gè)重要的病理生理過(guò)程。調(diào)控高遷移率族蛋白1(high mobility group protein， HMGB1)是一種非組織核蛋白，一旦從胞核內(nèi)釋放到細(xì)胞外，便會(huì)成為促炎因子加重心肌I/R損傷[1-2]，同時(shí)，HMGB1可以促進(jìn)經(jīng)典炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素(IL-6)的表達(dá)，進(jìn)而加重心肌I/R損傷[2]。抑制HMGB1的表達(dá)可以減輕心肌I/R損傷[2]。這些結(jié)果均提示HMGB1在心肌I/R損傷中發(fā)揮了重要作用。白介素33(IL-33)是2005年發(fā)現(xiàn)的白介素1家族的新成員[3]，存在于細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞壞死和凋亡時(shí)被釋放到細(xì)胞外，通過(guò)與其特異性受體ST2L結(jié)合發(fā)揮炎癥因子的作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，IL-33對(duì)多種心血管疾病所致心肌損傷有保護(hù)作用，包括I/R損傷[4-6]。另外，前期的研究顯示IL-33可以調(diào)節(jié)HMGB1的表達(dá)[7-8]。因此，筆者推測(cè)，IL-33可以通過(guò)調(diào)控HMGB1表達(dá)保護(hù)I/R心肌。本研究試對(duì)上述推斷及可能的機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制作和實(shí)驗(yàn)分組 SPF級(jí)成年雄性大鼠(200～250 g)32只，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物許可證號(hào)：42000500004956，42000500005085)。于可控的環(huán)境中(明/暗12 h交替)給予充足的水和食物，喂養(yǎng)48 h。大鼠I/R模型制作方法參照文獻(xiàn)[9]。隨機(jī)將大鼠分為4組，SO組(n=10)：大鼠開(kāi)胸，左前降支(LAD)下穿線，但不結(jié)扎；I/R組(n=10)：大鼠開(kāi)胸，結(jié)扎LAD 30 min，再灌注4 h；IL-33組(n=6)：結(jié)扎大鼠LAD 30 min前，尾靜脈注射IL-33(10 μg/只，美國(guó)Peprotech)，后缺血30 min，再灌注4 h；HMGB Ab組(n=6)：大鼠麻醉后，尾靜脈注射HMGB1中和抗體(100 μg/只，德國(guó)IBL)，在另一條尾靜脈注射IL-33(10 μg/只)，30 min后，結(jié)扎大鼠LAD，缺血30 min后，再灌注4 h。

1.2 血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)測(cè)定 大鼠缺血再灌注4 h后，經(jīng)頸靜脈取血2 ml，3000 r/min離心15 min，取血清，-80℃冰箱保存，選用南京建成生物工程研究所試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)規(guī)范操作，測(cè)定血清LDH和CK水平。

1.3 心肌組織TNF-α和IL-6檢測(cè) 再灌注4 h后，取結(jié)扎線水平以下的心肌，并剪除右心室，-80℃冰箱凍存至檢測(cè)。選用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行ELASIA檢測(cè)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)規(guī)范操作，測(cè)定心肌組織中TNF-α和IL-6。

1.4 心肌組織HMGB1、Caspase-3、Bcl-2、Bax檢測(cè) Western blot法檢測(cè)心肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)。取材方法同“1.3”，檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[10],根據(jù)分子質(zhì)量配制12%PAGE膠，電泳后轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂奶粉封閉，4℃孵育一抗過(guò)夜，對(duì)HMGB1、Caspase-3、Bcl-2、Bax、β-actin采用對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗孵育后，用ECL顯色。以β-actin為內(nèi)參計(jì)算上述蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 HMGB1 mRNA定量檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[11]從心肌組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計(jì)如表1所示，定量PCR反應(yīng)體系如表2所示。反應(yīng)條件：第1個(gè)循環(huán)，50℃×2 min，95℃×10 min；后40個(gè)循環(huán)，95℃×30 s，60℃×30 s。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)ABI，Vii7)測(cè)算出HMGB1 mRNA的含量。

表1 定量PCR引物

F為前向引物，R為反向引物

表2 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系(以b-240為例)

2 結(jié)果

2.1 血清LDH和CK水平 與SO組比較，I/R組血清中LDH和CK顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，IL-33組和HMGB1 Ab組血清LDH和CK顯著降低(P<0.05)；與IL-33組比較，HMGB1 Ab組CK顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.2 心肌組織TNF-α和IL-6表達(dá) 與SO組比較，I/R組心肌組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，IL-33組和HMGB1 Ab組心肌組織TNF-α和IL-6表達(dá)明顯降低(P<0.05)；HMGB1 Ab組TNF-α和IL-6的表達(dá)明顯高于IL-33組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.3 心肌組織Caspase-3和Bcl-2/Bax的表達(dá) 與SO組相比，I/R組中活化Caspase-3水平明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，IL-33組總Caspase-3和活化Caspase-3的表達(dá)顯著降低(P<0.05),HMGB1 Ab組活化Caspase-3表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與IL-33組比較，HMGB1 Ab組總Caspase-3和活化Caspase-3表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。I/R組Bcl-2/Bax明顯低于SO組(P<0.05)；與I/R組相比，IL-33組Bcl-2/Bax顯著升高(P<0.05)；HMGB1 Ab組Bcl-2/Bax顯著低于IL-33組(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

2.4 IL-33抑制HMGB1的表達(dá) 與SO組相比，I/R組HMGB1表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，IL-33組HMGB1表達(dá)顯著降低(P<0.05)；HMGB1 mRNA與HMGB1蛋白表達(dá)趨勢(shì)相同。見(jiàn)表3、圖1。

表3 4組大鼠相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

圖1 4組大鼠心肌組織Caspase-3、Bcl-2、Bax、HMGB1檢測(cè)結(jié)果

3 討論

IL-33是IL-1家族的第11個(gè)成員，不同于其他的IL-1家族因子，IL-33具有雙重作用，它既可以作為核因子調(diào)控細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)錄，也可以被釋放到細(xì)胞外，作為細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。目前已證實(shí)，IL-33作為炎癥因子時(shí)既可在過(guò)敏性炎癥中如過(guò)敏性皮炎、哮喘和風(fēng)濕性疾病中表現(xiàn)為促炎作用加重?fù)p傷，也可在多種心血管疾病以及組織的I/R損傷中表現(xiàn)為抗炎因子發(fā)揮保護(hù)作用，包括心肌I/R損傷[4-6,12-14]。Seki等[4]證實(shí)，IL-33可抑制小鼠心肌中Th1因子如INF-γ的表達(dá)，增加Th2因子如IL-4、IL-13的表達(dá)。Yin等[12]發(fā)現(xiàn)IL-33在小鼠心臟移植時(shí)也發(fā)揮相同的作用。Li等[13]在肝臟I/R研究中也發(fā)現(xiàn)，IL-33可以明顯減少肝臟中TNF-α、INF-γ的分泌，減輕肝臟炎癥，保護(hù)肝臟。Yndestad等[15]證實(shí)，IL-33可以抑制心肌組織TNF-α和IL-6的表達(dá)，減弱心肌炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論一致，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，IL-33可減少HMGB1的表達(dá)。HMGB1是一種新型的促炎因子，在心肌I/R損傷中發(fā)揮了重要作用[2,16-17]。它不但可以作為炎癥因子直接加重心肌I/R損傷，還可以作為促炎因子上調(diào)其他炎癥因子如TNF-α、IL-6的表達(dá)，進(jìn)而加重心肌損傷[2]。而抑制HMGB1的表達(dá)可以減弱I/R心肌炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌。本研究發(fā)現(xiàn)，加入HMGB1 Ab可明顯減弱IL-33的抗炎和心肌保護(hù)作用，提示IL-33可通過(guò)下調(diào)HMGB1表達(dá)減弱心肌炎癥反應(yīng)保護(hù)I/R心肌。

凋亡是心肌I/R損傷中一個(gè)重要的病理生理過(guò)程，抑制凋亡的發(fā)生可明顯減弱心肌I/R損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-33可降低活化Caspase-3的水平，增加Bcl-2/Bax，即減弱心肌細(xì)胞的凋亡水平、保護(hù)心肌，這和既往的研究結(jié)果一致[4-5]。Hu等[16]證實(shí)，HMGB1可促進(jìn)I/R中心肌細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。Ding等[19]和Zhu等[20]進(jìn)一步證實(shí)HMGB1-TLR4-IL-23-IL-17A軸可以通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡加重心肌I/R損傷。這些結(jié)果均提示，HMGB1可以促進(jìn)心肌I/R心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1 Ab可減弱IL-33的抗凋亡作用，進(jìn)一步印證了上述結(jié)論，提示IL-33可以通過(guò)下調(diào)HMGB1表達(dá)減弱I/R心肌凋亡，保護(hù)心肌。既往研究表明，核因子κB(NF-κB)通路是IL-33/ST2一條重要的下游通路[7]，抑制NF-κB可降低HMGB1的表達(dá)[8]，因此，筆者推斷，IL-33可能是通過(guò)NF-κB通路調(diào)控HMGB1的表達(dá)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究進(jìn)一步印證了IL-33可以通過(guò)減弱心肌炎癥和細(xì)胞凋亡而減輕心肌I/R損傷；同時(shí)首次證實(shí)了IL-33可通過(guò)下調(diào)HMGB1表達(dá)抑制心肌炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)I/R心肌。

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Interleukin 33 in Protecting Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury by Down Regulation of HMGB1 Expression in Rats

MA Rui-song1, JIANG Hong1, LI Yuan-hong2, HU Xiao-rong1, LI Xue-fei1

(1. Department of Cardiology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China; 2. Department of Cardiology, Central Hospital of Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture, Enshi, Hubei 445000， China)

Objective To investigate the protective effect of interleukin-33 (IL-33) on myocardial ischemia and reperfusion injury (I/R) by down regulation of high mobility group protein1 (HMGB1) expression in rats. Methods The 32 adult male SD rats were randomly divided into sham operation group (SO group,n=10), I/R group (n=10), IL-33 group (n=6) and HMGB1 antibodies group (HMGB1 Ab group,n=6). The rats in SO group underwent chest cutting operation, and a suture was passed through the myocardium beneath the left anterior descending (LAD) without ligation; while the I/R models were established in rats in the rats in other 3 groups, and the rats in IL-33 and HMGB1 Ab groups were treated with IL-33 10μg and IL-33 10μg + HMGB1 neutralizing antibody respectively by vena caudalis injection 30 min before the model establishment. The levels of serum lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK), and expressions of tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-6, HMGB1, total Caspase-3, cleaved Caspase-3, Bcl-2 and Bax in all groups were detected, and HMGB1 mRNA levels in SO, I/R and IL-33 groups were quantificationally detected. Results After reperfusion for 4 h, IL-33 could significantly decrease LDH and CK levels and the TNF-α， IL-6, HMGB1 and Bax expressions, and Caspase-3 activation (P<0.05), but increase the Bcl-2 expression (P<0.05); while HMGB1 could weaken protective effect of IL-33 (P<0.05). Conclusion IL-33 may inhibit myocardial inflammatory reaction and apoptosis by inhibiting HMGB1 expression in myocardial tissues so as to protect I/R myocardium.

Myocardial reperfusion injury; Interleukin-33； High mobility group protein 1； Rat, Sprague-Dawley

國(guó)家自然科學(xué)基金(81370308)

430060 武漢，武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科(馬瑞松、江洪、胡笑容、李雪飛)；445000 湖北 恩施土家族苗族自治州，恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院心內(nèi)科(李元紅)

李元紅,Email：lyh0101@vip.163.com

R542.2；R-332

A

2095-140X(2015)08-0041-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.08.011

2015-04-23 修回時(shí)間：2015-05-13)