乙型肝炎相關(guān)性肝癌根治性切除術(shù)后HBV二次激活的因素分析及機制探討

江 濤，何 謙，張誠華，杜振雙

·論著·

乙型肝炎相關(guān)性肝癌根治性切除術(shù)后HBV二次激活的因素分析及機制探討

江 濤，何 謙，張誠華，杜振雙

目的 通過觀察乙型肝炎(乙肝)相關(guān)性肝癌患者行肝癌根治性切除術(shù)術(shù)前、術(shù)后血清乙肝病毒DNA(HBV-DNA)載量、血清炎癥因子的變化，探討HBV二次激活的因素。方法 將行肝癌根治性切除術(shù)、尚未達(dá)到抗病毒標(biāo)準(zhǔn)的60例乙肝相關(guān)性肝癌納入研究，檢測術(shù)前及術(shù)后第3天HBV-DNA、IL-6、IL-10、IL-27水平。根據(jù)術(shù)后第3天HBV-DNA載量變化將60例分為升高組(HBV-DNA載量升高1個及1個以上數(shù)量級)及正常組(HBV-DNA載量無變化或者升高不足1個數(shù)量級)。比較兩組一般資料，篩選出影響HBV-DNA載量變化的相關(guān)因素進行多因素logistic回歸分析。結(jié)果 ①術(shù)后第3天HBV-DNA載量較治療前升高1個及1個以上數(shù)量級者27例(升高組)，其中21例(77.78%)術(shù)前HBV-DNA載量<104U/ml；HBV-DNA載量較治療前無變化或者升高不足1個數(shù)量級者33例(正常組)。②logistic分析顯示，腫瘤直徑、肝切除范圍、術(shù)中注射無水酒精是導(dǎo)致患者術(shù)后HBV-DNA載量升高的獨立危險因素。③與本組術(shù)前比較，升高組術(shù)后第3天血清IL-10、IL-27水平升高(P<0.01)，IL-6無顯著變化(P>0.05)；正常組術(shù)后第3天血清IL-6、IL-27水平升高，IL-10水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 手術(shù)應(yīng)激及其引起炎癥因子IL-6及IL-10水平變化是乙肝相關(guān)性肝癌患者肝癌根治性切除術(shù)后HBV二次激活的可能機制；圍術(shù)期監(jiān)測患者HBV-DNA載量變化具有重要意義。

肝腫瘤；乙型肝炎,慢性；外科手術(shù)；乙型肝炎病毒DNA

我國是乙型肝炎(乙肝)高發(fā)國家，根據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查，目前約有3.5億國民是乙肝病毒(HBV)的攜帶者。國際癌癥協(xié)會于2009年調(diào)查發(fā)現(xiàn),約80%的原發(fā)性肝癌患者與HBV有關(guān)[1]。自20世紀(jì)90年代我國普及乙肝疫苗以來，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率有所下降，但仍有8% 90年代之前出生的人乙肝表面抗原呈現(xiàn)陽性[2]，故未來半個世紀(jì)乙肝相關(guān)性肝癌仍是我國一個重要的衛(wèi)生問題。手術(shù)是目前治療肝癌的主要手段，有文獻(xiàn)報道化療及經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化療栓塞(TACE)可引發(fā)乙肝相關(guān)性肝癌患者體內(nèi)HBV二次激活，進而導(dǎo)致肝功能的損害[3]，但肝臟切除術(shù)是否也可引起HBV的二次激活仍處于研究階段。本研究將60例未達(dá)到抗病毒治療標(biāo)準(zhǔn)的乙肝相關(guān)性肝癌患者作為研究對象，通過觀察肝癌根治性切除術(shù)后患者血清HBV-DNA載量的變化，探討HBV二次激活的因素及可能機制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象與分組 選擇解放軍180醫(yī)院2011年1月—2013年3月收治的行肝癌根治性切除術(shù)的慢性乙肝相關(guān)性肝癌患者60例，男36例，女24例；年齡49～68(48.0±5.1)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：①經(jīng)過影像學(xué)手段評估認(rèn)為適合接受肝癌根治性切除術(shù)；②術(shù)前未接受任何形式的抗病毒治療，術(shù)后病理切片證實為肝細(xì)胞癌；③HBeAg(+)者HBV-DNA載量低于105U/ml，HBeAg(-)者HBV-DNA載量低于104U/ml，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)低于80 U/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往接受過抗病毒治療者；②既往接受TACE者或肝臟切除術(shù)后復(fù)發(fā)者；③合并嚴(yán)重心腦腎等重大臟器疾病者；④拒絕簽署知情同意書者。根據(jù)術(shù)后第3天HBV-DNA載量變化情況將60例慢性乙肝相關(guān)性肝癌患者分為升高組及正常組，其中HBV-DNA載量增加1個及1個以上數(shù)量級者為升高組,HBV-DNA載量與術(shù)前屬于同一數(shù)量級者為正常組。

1.2 觀察指標(biāo) 術(shù)前及術(shù)后第3天檢測血清白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-27(IL-27)、HBV-DNA水平。

1.2.1 IL-6、IL-10及IL-27檢測方法：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進行檢測，研究對象空腹、操作無菌狀態(tài)下用無肝素真空采血管采集肘靜脈血5 ml，1 h內(nèi)離心10 min(3000 r/min)，分離并吸取上層血清，即刻檢測或4℃保存3 d內(nèi)檢測。檢測前樣本恢復(fù)至室溫，不可反復(fù)復(fù)溫。ELISA試劑盒由廣州達(dá)安基因股份有限公司提供，酶標(biāo)儀、洗板機由上海滬峰生物科技有限公司提供。根據(jù)說明書進行上樣、孵育、洗滌、加酶標(biāo)抗體、顯色、數(shù)據(jù)讀取。在ELISA檢測儀上，于450 nm[若以總抗氧化能力檢測法(ABTS)顯色，則于410 nm]處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔吸光度(OD)值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

1.2.2 HBV-DNA檢測方法：采用熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定量檢測，根據(jù)NCBI中Genebank基因庫的設(shè)計引物序列，擴增片段長度100～300 bp。用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水過夜室溫或37℃處理,1.5 ml EP管和取液用10、200 μl和1 ml Tip,高溫蒸氣滅菌，80℃烘干備用。加入1 ml Trizol剪碎，振蕩30 s；加0.2 ml氯仿，12000 g、4℃離心15 min；輕輕吸取上層無色水相至0.5 ml EP管中；加等體積異丙醇后12 000 g、4℃離心10 min；在管底部可見微量RNA沉淀。加入75%乙醇1ml，棄上清，干燥后用DEPC水溶解RNA，根據(jù)所RNA濃度，計算RNA體積。Real-Time PCR操作方法按照試劑盒說明書，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)部參照，將GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，通過ABI7500軟件獲得檢測指標(biāo)循環(huán)閾(cycle threshold,Ct)值，與同樣本中GAPDH的Ct值相減，即獲得該樣本中相應(yīng)指標(biāo)的ΔCt值。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)情況 60例手術(shù)均順利，未出現(xiàn)肝性腦病、難治性腹水等嚴(yán)重并發(fā)癥，無一例死亡。

2.2 術(shù)后HBV-DNA載量變化及分組 術(shù)后第3天HBV-DNA載量較治療前升高1個及1個以上數(shù)量級者27例(升高組)，其中21例(77.78%)術(shù)前HBV-DNA載量<104U/ml；HBV-DNA載量較治療前無變化或者升高不足1個數(shù)量級者33例(正常組)。

2.3 術(shù)后不同HBV-DNA載量兩組一般資料比較 肝切除范圍、腫瘤直徑、術(shù)中注射無水酒精與HBV-DNA載量升高有一定的相關(guān)性(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 乙肝相關(guān)性肝癌患者根治性切除術(shù)后不同乙肝病毒-DNA載量兩組一般資料比較

2.4 術(shù)后HBV-DNA載量升高多因素logistic回歸分析結(jié)果 多因素logistic回歸分析顯示，肝切除范圍、腫瘤直徑、術(shù)中注射無水酒精是導(dǎo)致HBV相關(guān)性肝癌患者根治性切除術(shù)后HBV-DNA載量升高的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 乙肝相關(guān)性肝癌患者根治性切除術(shù)后乙肝病毒-DNA載量升高多因素logistic回歸分析結(jié)果

2.5 兩組術(shù)前、術(shù)后血清炎癥因子變化比較 與本組術(shù)前比較，升高組術(shù)后第3天血清IL-10、IL-27水平升高(P<0.01)，IL-6無顯著變化(P>0.05)；正常組術(shù)后第3天血清IL-6、IL-27水平升高，IL-10水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表3。

3 討論

近年來研究證實乙肝相關(guān)性肝癌患者體內(nèi)的HBV可在化療過程中被再次激活，導(dǎo)致肝功能進一步受損[4]。這一現(xiàn)象在淋巴瘤、乳腺癌患者尤為明顯，約26%淋巴瘤患者存在HBV感染，經(jīng)過化療治療后約有47%HBV感染者出現(xiàn)HBV-DNA載量明顯上升。有資料顯示約有40%乳腺癌患者接受化療后出現(xiàn)HBV-DNA載量上調(diào)[5]。湯靚等[6]進行一項前瞻性多中心大樣本研究顯示，HBV再次激活是慢性淋巴瘤患者化療預(yù)后的影響因子。

在我國約有2000萬慢性乙肝患者，其中15%～20%轉(zhuǎn)歸為肝硬化，而肝癌是肝硬化最可能的演變趨勢[7]。目前手術(shù)仍是肝癌的主要治療手段，但手術(shù)對患者的免疫功能也會產(chǎn)生不良影響，可能導(dǎo)致HBV的二次激活。許彥杰等[7]證實原發(fā)性肝癌患者術(shù)后HBV-DNA載量升高與肝功能受損呈顯著正相關(guān)，且HBV-DNA載量越高患者術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的可能性就越大。本研究對60例術(shù)前未達(dá)到抗病毒治療標(biāo)準(zhǔn)的乙肝相關(guān)性肝癌患者進行研究，發(fā)現(xiàn)有45%的患者術(shù)后HBV-DNA載量升高，其中77.78%(21/27)術(shù)前HBV-DNA載量<104U/ml。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為術(shù)前HBV-DNA載量越高的患者術(shù)后HBV激活的概率越高[7]，但是本研究結(jié)果卻顯示術(shù)前低HBV-DNA載量的肝癌患者術(shù)后同樣易出現(xiàn)病毒激活，提示術(shù)前低病毒載量的患者圍術(shù)期同樣不能忽視抗病毒治療。

表3 乙肝相關(guān)性肝癌患者根治性切除術(shù)后不同HBV-DNA載量兩組術(shù)前、術(shù)后血清炎癥因子水平變化

本研究對患者的臨床資料行進一步分析發(fā)現(xiàn)，年齡、性別、血清ALT、門靜脈高壓、Child-Pugh分級、甲胎蛋白、腫瘤距切緣距離、多發(fā)病灶、手術(shù)時間、組織學(xué)分化均與術(shù)后HBV-DNA載量升高無關(guān)，而肝臟切除范圍、腫瘤直徑、術(shù)中注射無水酒精是導(dǎo)致患者術(shù)后HBV-DNA載量升高的獨立危險因素。肝癌根治性切除術(shù)后僅有功能正常的肝組織存留，體內(nèi)多種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)破壞了肝細(xì)胞內(nèi)相對平衡的免疫狀態(tài)，許彥杰等[7]認(rèn)為術(shù)后肝組織容易產(chǎn)生代償性再生，而HBV具有顯著的嗜肝性，對代償再生的肝臟新組織繼續(xù)侵犯，從而導(dǎo)致HBV-DNA載量升高。因此筆者推測，當(dāng)肝腫瘤直徑<5 cm時，肝組織切除范圍較少，代償再生的肝組織較少，再次被HBV侵犯的肝體范圍不大，HBV-DNA載量變化不明顯；當(dāng)腫瘤直徑≥10 cm時，切除的肝組織范圍較大，大量的HBV伴隨肝組織被移出體外，存留的肝組織體積較小，短時間內(nèi)代償再生能力較低，患者術(shù)后HBV-DNA載量變化同樣不明顯；腫瘤直徑為5～10 cm的患者，手術(shù)切除后肝組織代償再生明顯，HBV有了大量復(fù)制侵犯的條件，故術(shù)后HBV-DNA載量明顯上調(diào)。本研究還發(fā)現(xiàn)術(shù)中注射無水酒精也是術(shù)后HBV-DNA載量升高的獨立危險因素，具體機制目前尚未明了，有待進一步研究證實。

本研究進一步探討術(shù)后HBV二次激活的機制，發(fā)現(xiàn)免疫功能下降增加了HBV二次激活的風(fēng)險。有資料顯示,IL-6可抑制HBV的復(fù)制，IL-6水平下降提示患者免疫功能下降，HBV將可能進一步復(fù)制[8]。本研究結(jié)果顯示，正常組術(shù)后第3天IL-6水平顯著高于術(shù)前，提示IL-6濃度的升高抑制了HBV復(fù)制，因此正常組HBV未出現(xiàn)明顯二次激活現(xiàn)象。目前諸多文獻(xiàn)證實IL-10是人體多效細(xì)胞因子,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，機體免疫功能隨著IL-10濃度增加而降低，病毒復(fù)制越明顯，其對機體侵犯的可能性就越大，加速了宿主肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肝癌細(xì)胞的進程[9-10]。本研究中升高組IL-10水平與術(shù)前比較升高，而正常組具有相反趨勢。這一結(jié)果與劉蘭等[9]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示兩組術(shù)后第3天IL-27水平均較術(shù)前升高，說明IL-27濃度變化與HBV再次激活無關(guān)，但有研究認(rèn)為IL-27在HBV感染初期具有保肝效應(yīng)，且具有抑制腫瘤細(xì)胞過度增殖的作用[11]，所以筆者認(rèn)為，雖然IL-27濃度水平變化與HBV二次激活無關(guān)，但其高表達(dá)亦屬于機體自我保護HBV破壞肝組織的表現(xiàn)。

總之，腫瘤大小、肝切除范圍及術(shù)中注射無水酒精是乙肝相關(guān)性肝癌患者根治性切除術(shù)后HBV二次激活的獨立危險因素，手術(shù)應(yīng)激及其引起炎癥因子IL-6及IL-10水平變化是HBV二次激活的可能機制，因此，圍術(shù)期監(jiān)測患者HBV-DNA載量變化具有重要意義。

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Factor Analysis and Mechanism Research of the Second Activated Hepatitis B Virus DNA in Patients with HBV-related Hepatocellular Carcinoma after Hepatic Carcinectomy

JIANG Tao, HE Qian, ZHANG Cheng-hua, DU Zhen-shuang

(Department of General Surgery, 180 Hospital of PLA, Quanzhou, Fujian 362000, China)

Objective To observe the changes of serum hepatitis B virus DNA (HBV-DNA) capacities and inflammatory factors before and after the hepatic carcinectomy in patients with HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC)， and to investigate the risk factors of the second activated HBV DNA. Methods A total of 60 HBV-related HCC patients undergoing hepatic carcinectomy without the recommended level of antiviral treatment were recruited in this study. The levels of serum HBV-DNA， IL(interleukin)-6， IL-l0 and IL-27 before and on the 3rdd after the operation were detected. The patients were divided into the increasing group (increasing HBV-DNA load ≥ 1 magnitude order) and normal group (increasing HBV-DNA load ≤ 1 magnitude order) according to HBV-DNA loads on the 3rdd after the operation． The general data in the two groups were compared, and then logistic regression analysis was performed for choosing related factors of HBV-DNA loads. Results There were 27 patients in the increasing group including 21 patients (77.78%, 21/27) with preoperative serum levels of HBV-DNA less than 104U/ml; there were 33 patients in the normal group. Logistic regression analysis showed that tumor diameter, hepatectomize extent and intraoperative anhydrous alcohol injection were independent risk factors for postoperative HBV-DNA load increases. Compared with those before the operation, in the increasing group on the 3rdd after the operation, serum IL-10 and IL-27 levels were significant increased (P<0.01), but there was no significant difference in IL-6 level (P>0.05). Compared with those before the operation, in normal group, serum on the 3rdd after the operation, serum IL-6 and IL-27 levels were increased, while IL-10 level was decreased, and the differences were statistically significant (P<0.05，P<0.01). Conclusion Surgical stress and its induced changes of inflammatory factors IL-6 and IL-l0 levels may be possible mechanisms of the second activated HBV-DNA in patients with HBV-related hepatocellular carcinoma after the hepatic carcinectomy, and it is important to monitor changes of HBV-DNA load in perioperative patients.

Liver neoplasms; Hepatitis B, chronic; Surgical procedures； HBV-DNA

362000 福建 泉州，解放軍180醫(yī)院普通外科

R735.7；R512.62

A

2095-140X(2015)08-0033-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2015.08.009

2015-05-16 修回時間:2015-06-09)