液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查與確證中華鱉中未知著色劑

李詩言, 王 揚, 周 凡, 鄭重鶯, 張海琪, 何中央*, 何 欣

(1. 浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心, 浙江 杭州 310023; 2. 浙江工商大學食品與生物工程學院, 浙江 杭州 310035)

研究論文

液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查與確證中華鱉中未知著色劑

李詩言1, 王 揚1, 周 凡1, 鄭重鶯1, 張海琪1, 何中央1*, 何 欣2

(1. 浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心, 浙江 杭州 310023; 2. 浙江工商大學食品與生物工程學院, 浙江 杭州 310035)

建立了液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(LC-Q-TOF MS)對中華鱉中未知著色劑的快速篩查方法。20個中華鱉樣品經(jīng)過簡易的乙腈提取凈化后,利用液相色譜-二極管陣列檢測器(LC-DAD)對未知著色劑進行定位。選定其中響應最強的樣品S7,同時在線獲取其在不同洗脫程序下未知著色劑定位時間段的質(zhì)譜信息,經(jīng)陰性樣品扣除本底后匹配獲得一對精確質(zhì)量數(shù)差異在5 mDa以內(nèi)的特征提取離子(分別為564.397 73 Da和564.395 61 Da)。通過質(zhì)譜定性分析處理軟件對上述特征提取離子對進行分子式生成,確認兩者分子式為C40H52O2,推測其同為未知著色劑。結合該未知著色劑的紫外-可見光譜信息與文獻資料,推斷該化合物可能為角黃素。通過角黃素標準品建立的飛行時間質(zhì)譜“二級確證譜庫”對樣品中未知著色劑進行進一步的匹配確證,最終確證其為角黃素。本研究討論了基于LC-Q-TOF MS方法的化合物篩查策略,實驗表明其可快速對中華鱉中的未知著色劑進行篩查和確證。

液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法;未知物鑒定;著色劑;中華鱉

對于化合物的篩查方法大致可以歸類為以下3種:(i)目標化合物篩查:通過標準品獲得化合物信息進行匹配篩查;(ii)半目標化合物篩查:沒有化合物標準品,通過已有的篩查化合物列表和相關信息進行匹配篩查;(iii)未知化合物篩查:化合物完全未知,通過提取化合物相應信息進行綜合分析推斷化合物構成,再進一步進行篩查與確證[1]。目前對于未知化合物的鑒定工作,主要通過核磁共振、紅外光譜、質(zhì)譜等儀器手段。其中飛行時間質(zhì)譜因其具有高分辨率和高質(zhì)量數(shù)準確度等特點,被認為是在未知化合物篩查鑒定方面的一種有效技術手段[2]。未知化合物篩查分析工作需要處理海量數(shù)據(jù),沒有相應的數(shù)據(jù)分析軟件,就需要耗費大量的處理時間。通過結合色譜分離技術與軟件信息學技術,飛行時間質(zhì)譜可進一步提高篩查效率,并能對復雜樣品基質(zhì)中未知化合物進行篩查確證,目前該技術已經(jīng)開始在食品安全分析、環(huán)境可持續(xù)污染物分析以及藥物代謝分析等領域得到了應用[3-8]。

近年來,有不法商販把養(yǎng)殖的中華鱉著色染黃后冒充野生鱉售賣,以獲取更大的經(jīng)濟利益。這些著色劑成分不明,對人體存在著潛在的食品安全風險。本研究通過高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法對中華鱉體內(nèi)未知著色劑進行定性分析,結合紫外光譜數(shù)據(jù)、軟件信息處理等方法綜合推測出未知著色劑并進行確證,探討了基于飛行時間質(zhì)譜技術的未知物篩查方法策略,為相關執(zhí)法、監(jiān)督工作提供了檢測依據(jù),具有重要的現(xiàn)實意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290-6540液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(LC-Q-TOF MS),配有二極管陣列檢測器(DAD)和Dual Agilent Jet Stream Electrospray Ionization(Dual AJS ESI)源(美國安捷倫公司);菲恰爾TDL-5A離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司); MassHunter工作站(美國安捷倫公司); Sigma 2-6E離心機(德國Sigma公司); N-EVAP 112水浴式氮吹濃縮儀(美國Organomation Associates, Inc.); IKA MS 3 BS 25快速混勻器(德國IKA集團); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

角黃素標準品(CAS: 514-78-3,純度98.3%,德國Dr. Ehrenstorfer公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國TEDIA公司);甲酸(HPLC純,美國ROE Scientific Inc.)。

20個中華鱉樣品在杭州地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場購得,均體色異常發(fā)黃。取靠近皮膚組織肌肉部分(包括皮膚)絞碎制成均勻糜狀樣品。

1.2 實驗步驟

1.2.1 樣品制備

稱取2.0 g(精確到0.01 g)中華鱉糜狀肉質(zhì)樣品于50 mL聚四氟乙烯螺旋蓋離心管中,加入10 mL乙腈充分渦旋混合均勻后超聲提取10 min, 3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min,取上清液;重復上述提取步驟,合并上清液,在不超過40 ℃下氮吹至近干;用乙腈定容至1 mL, 8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心2 min,取上清液過濾膜,待上機測定。

1.2.2 中華鱉中未知著色劑的LC-DAD/Q-TOF MS篩查分析

對中華鱉樣品進行LC-DAD檢測,同時在線進行Q-TOF MS數(shù)據(jù)采集。結合紫外光譜數(shù)據(jù),利用安捷倫公司的質(zhì)譜定性分析數(shù)據(jù)處理軟件(MassHunter Qualitative Analysis B.5.00)對樣品進行分析,憑借內(nèi)置算法分子特征提取(molecular feature extraction, MFE)和分子式生成(molecular formula generation, MFG)軟件對疑似未知著色劑進行定性分析。

1.2.3 中華鱉中未知著色劑的確證

購買1.2.2節(jié)分析得出的疑似目標化合物標準品,建立其一級篩查譜庫和二級確證譜庫，對中華鱉中未知著色劑進行匹配篩查確證。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜方法A 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm)。柱溫:30 ℃。進樣量:5 μL。DAD掃描波長:250～800 nm。流動相:A為5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%(v/v)甲酸), B為乙腈;流速:250 μL/min;梯度洗脫程序:0～2 min, 5%B; 2～8 min, 5%B～80%B; 8～15 min, 80%B～90%B; 15～16 min, 90%B～98%B; 16～20 min, 98%B。

色譜方法B 梯度洗脫程序:0～1 min, 90%B; 1～5 min, 90%B～98%B; 5～7 min, 98%B;其余條件同色譜方法A。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源:Dual AJS ESI源;掃描方式:正離子全掃描。一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為單極質(zhì)譜全掃描模式,掃描范圍:m/z50～1 000,采集速率為2 spectra/s。二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集為目標離子采集模式,掃描范圍:m/z50～1 000,采集速率為2 spectra/s,碰撞能量為10、20和40 eV。采集數(shù)據(jù)時采用參比液(含有C5H4N4,其離子精確質(zhì)量數(shù)為121.050 873 Da)實時質(zhì)量校準。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理參數(shù)

MFE按下面參數(shù)條件進行:目標數(shù)據(jù)類型為小分子化合物,色譜方式進樣;提取峰高強度大于500;提取離子最大帶電荷數(shù)2;同一化合物離子數(shù)目為2或者更多;其他參數(shù)為缺省。MFG按下面參數(shù)條件進行:匹配總得分(overall score)涉及質(zhì)量得分(mass score)、同位素強度得分(isotope abundance score)以及同位素間距得分(isotope spacing score)3個因素,三者的權重值分別為100、60和50;元素組成及個數(shù)范圍:C(3～500)、H(5～1 000)、O(0～20)、N(0～20)、S(0～10)、F(0～10)、P(0～10)、Cl(0～10)和Br(0～10);其他參數(shù)為缺省。

1.3.4 著色劑篩查譜庫

利用安捷倫公司的個人化合物數(shù)據(jù)庫軟件(personal compound datebase and library, PCDL)建立了包括角黃素、檸檬黃、誘惑紅等43種禁用和限用紅黃色著色劑的“雙譜庫”(一級篩查譜庫和二級確證譜庫)。其中一級篩查譜庫通過化合物分子式以及精確質(zhì)量數(shù)等信息建立;二級確證譜庫通過化合物標準品,采集相應化合物的MS/MS譜圖信息建立。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理

常見的紅黃類色素種類繁多,化學性質(zhì)差異大(如有脂溶性的蘇丹紅類色素,也有水溶性的莧菜紅色素等),找到合適的提取試劑非常重要。有報道[9-11]顯示乙腈能夠提取食品中的蘇丹紅類色素、堿性橙類色素、羅丹明類色素、葉黃素、胭脂紅和莧菜紅等色素。乙腈極性適中,能夠同時提取極性和極性偏弱類化合物,適用范圍較廣泛。在周法東等[11]的研究中采用乙腈作為提取試劑,超聲輔助簡易提取了肉制品中的8種不同化學性質(zhì)的紅色色素,本研究參考了其前處理方法,對2.0 g中華鱉肉質(zhì)樣品采用20 mL乙腈分兩次超聲輔助簡易萃取,濃縮后上樣分析。肉類樣品主要的基質(zhì)干擾物為蛋白質(zhì)與脂肪,以乙腈為提取試劑提取，相比乙酸乙酯與丙酮提取的基質(zhì)脂肪含量較少,且乙腈的蛋白質(zhì)沉淀作用能夠獲得更為純凈的基質(zhì),更有利于后續(xù)的篩查分析。

2.2 未知著色劑的LC-DAD分析

由于已知中華鱉樣品中的著色劑呈紅黃色,因此通過DAD數(shù)據(jù)對目標化合物進行定位分析是可行的方法[12]。為了更有效地獲取目標化合物的質(zhì)譜信息,本研究采用陰性樣品對照,外加兩次在不同色譜條件下洗脫進行雙定位，獲取兩次質(zhì)譜信息并進行交叉匹配來排除干擾。未知著色劑的化學性質(zhì)不明,因此首先采用色譜方法A進行定位分析,其洗脫條件被設計為一個大梯度的洗脫程序(從5%低比例有機相到98%高比例有機相),保證了極性化合物和弱極性化合物都能被洗脫下來。按照1.3.1節(jié)中色譜方法A對20個中華鱉樣品進行LC-DAD/Q-TOF MS檢測,結果20個樣品中有14個樣品在15.1 min左右出現(xiàn)可見光區(qū)波長段響應峰,該峰最大吸收波長為470 nm,符合紅黃色物質(zhì)的吸收波長范圍,確定其為目標化合物響應峰。結合色譜方法A參數(shù)可知目標化合物在高比例有機相時間段(80%以上比例的有機相)出峰,推測目標化合物為弱極性化合物,因此設計高比例有機相的色譜方法B(從90%有機相到98%有機相)作為 第二次色譜分離的條件。色譜方法B在保證目標化合物得以順利洗脫的同時,能夠排除色譜方法A中部分極性稍強的共流出化合物對后續(xù)質(zhì)譜分析的干擾。選取在色譜方法A中響應最強編號為S7的樣品按照1.3.1節(jié)中色譜方法B再次進行LC-DAD/Q-TOF MS檢測,未知著色劑在兩次DAD檢測的保留時間分別為15.099 min和5.032 min(見圖1)。

圖 1 S7號樣品的LC-DAD譜圖Fig. 1 LC-DAD chromatograms of the S7 sample a. LC-DAD detection with chromatographic process A: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 column (100 mm×2.1 mm, 3.5 μm); column temperature: 30 ℃; injection: 5 μL; DAD detection wavelengths: 250-800 nm; mobile phases: 5 mmol/L ammonium acetate (containing 0.1%(v/v) formic acid) (A) and acetonitrile (B); flow rate: 250 μL/min; gradient elution program: 0-2 min, 5%B; 2-8 min, 5%B-80%B; 8-15 min, 80%B-90%B; 15-16 min, 90%B-98%B; 16-20 min, 98%B. b. LC-DAD detection with chromatographic process B: gradient elution program: 0-1 min, 90%B; 1-5 min, 90%B-98%B; 5-7 min, 98%B. Others are the same as chromatographic process A.

2.3 未知著色劑的LC-Q-TOF MS分析

2.3.1 分子特征提取

在色譜方法A和B條件下S7號樣品的總離子流圖(total ion chromatogram, TIC)見圖2。參照LC-DAD檢測結果定位著色劑,按照1.3.3節(jié)中MFE算法參數(shù),分別提取S7號樣品和陰性樣品在色譜方法A條件下14.500～16.000 min時間段的特征化合物信息,以及色譜方法B條件下4.500～5.500 min時間段的特征化合物信息。一般在篩查未知化合物的工作中對精確質(zhì)量數(shù)相差要求控制在5 mDa以內(nèi)[13]。按此條件將色譜方法A和B下獲取的化合物質(zhì)譜信息扣除陰性樣品本底后進行交叉匹配,共篩查出一對精確質(zhì)量數(shù)分別為564.397 73 Da和564.395 61 Da的匹配離子對。兩者編號分別為化合物5和化合物8,保留時間分別為15.196 min和5.108 min,質(zhì)量偏差為2.12 mDa(見表1),推測其同為未知著色劑。通常對于未知化合物的鑒定分析工作需要研究人員靠視覺經(jīng)驗從總離子流圖中提取化合物的質(zhì)譜信息。由于樣品基質(zhì)的復雜性,從譜圖數(shù)據(jù)中找出有效的化合物信息是非常困難的?；贛assHunter軟件的MFE算法可根據(jù)采集所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)的保留時間以及精確質(zhì)量數(shù),將化合物的相關質(zhì)譜信息從海量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中提取出來,有效提高了未知化合物的提取效率。

圖 2 S7號樣品的LC-Q-TOF MS總離子流圖Fig. 2 Total ion chromatograms of the S7 sample by LC-Q-TOF MS a. LC-Q-TOF MS detection with chromatographic process A; b. LC-Q-TOF MS detection with chromatographic process B. The chromatographic processes A and B are the same as in Fig. 1.表 1 不同梯度洗脫條件下中華鱉中疑似未知化合物提取交叉匹配結果Table 1 Results of suspected non-target compound molecular feature extraction cross-mapping in Chinese softshell turtle with different gradient elution programs

ChromatographicprocessSampleNon-targetscreeningresulta)CompoundcodeRT/minΔRTb)/minMass/DaΔMassc)/mDaAS714515.1960.097564.397732.12BS7-22085.1080.076564.39561

a) The number of MFE compound results excluded negative sample background spectrum information in gradient elution programs A and B. b) The ΔRT of the retention times (RTs) of selected compound in LC-DAD and LC-Q-TOF MS chromatograms. c) The difference between the observed mass of the selected compound detected by different LC methods.

2.3.2 分子式生成

基于MassHunter軟件的MFG算法,同時參照了提取化合物的同位素分布和質(zhì)量精確度數(shù)據(jù),匹配結果能夠剔除大部分不正確的分子式,提高了未知化合物鑒定分析的準確度和可靠性。按照1.3.3節(jié)中MFG算法參數(shù)對MFE結果中色譜方法A的化合物5和色譜方法B的化合物8進行分子式生成,結果兩者最佳匹配分子式均為C40H52O2(見圖3),匹配得分為97.11和96.73。通過分子式生成進一步驗證了色譜方法A和色譜方法B下分別提取的化合物5和化合物8同為疑似目標著色劑,并確定了該未知著色劑的分子式為C40H52O2。

圖 3 S7號樣品中疑似未知化合物的MFG結果Fig. 3 MFG results of the suspected non-target compound in the S7 sample

2.4 未知著色劑的確證

未知著色劑的分子式確認為C40H52O2,最大吸收波長為470 nm,參照文獻[14,15],推斷該未知著色劑可能為角黃素(canthaxanthin)。按照1.2.3節(jié)的方法,添加角黃素標準品數(shù)據(jù)進入著色劑篩查“雙譜庫”,并對S7號樣品進行“雙譜庫”匹配確證。結果S7號樣品經(jīng)一級譜庫篩查檢出角黃素,匹配得分為97.27;二級譜庫確證結果匹配得分為89.31。從S7樣品在10 eV碰撞能量下的二級質(zhì)譜碎片鏡像對比圖(見圖4)中可以看出,S7號樣品的疑似化合物母離子(m/z565.402 93)的子離子碎片m/z133.064 17、203.142 71、363.267 13、413.283 91、473.339 54能夠與角黃素標準品的子離子碎片匹配上。由于樣品基質(zhì)的干擾,部分干擾離子如m/z566.498 08影響了匹配得分,但從局部放大圖可以看出,未知著色劑的母離子同位素峰匹配良好,完全滿足歐盟2002/657/EC決議中對高分辨率質(zhì)譜確證化合物的定性要求。經(jīng)過“雙譜庫”的篩查鑒定,最終確證了中華鱉中未知著色劑為角黃素。

圖 4 S7號樣品中疑似未知化合物的二級質(zhì)譜碎片鏡像對比圖Fig. 4 Mirror image of MS/MS of suspected non-target compound in the S7 sample

2.5 基于LC-Q-TOF MS技術的篩查分析策略

在LC-Q-TOF MS篩查方法中,對于化合物的定性鑒定工作主要是通過與預先建立好的質(zhì)譜譜庫匹配來進行的,即半目標化合物篩查。如在林慧等[16]的研究中通過LC-Q-TOF MS方法對牛肉中未知色素進行篩查和譜庫匹配篩查,結果成功檢出了剛果紅;Domínguez-Romero等[17]同樣通過LC-Q-TOF MS技術對尿液中200種運動類藥物進行篩查確證,其中大部分藥物運用篩查譜庫進行半目標化合物篩查,少部分藥物與其代謝物通過質(zhì)譜信息進行推斷鑒定。本研究初始按照1.2.1節(jié)方法進行樣品預處理,采用1.3.1節(jié)的儀器條件(采用色譜方法A)上機分析,運用1.3.4節(jié)的著色劑一級篩查譜庫(最初未包含角黃素)進行初篩,結果未有任何著色劑檢出。這說明在實際篩查檢測工作中,“雙譜庫”的建設對于LC-Q-TOF MS的篩查分析至關重要。篩查譜庫越完善,篩查的范圍也就越廣,鑒定結果就越準確,檢測效率也就越高[18]。

由于譜庫建設的局限性,檢測人員時常會面對未知化合物的篩查鑒定工作,LC-Q-TOF MS技術對于未知化合物的鑒定優(yōu)勢便是能夠獲得化合物的精確質(zhì)量數(shù)進而確定其分子式,并通過二級碎片信息進行結構推斷。但在實際樣品中,復雜的基質(zhì)使得化合物的提取信息過于龐雜,因此就需要運用其他技術手段來進一步縮小篩查范圍。本研究考慮要未知化合物為有色物質(zhì),因此通過在線LC-DAD的檢測結果來輔助定位目標化合物。同時,為了進一步減少樣品基質(zhì)帶來的化合物信息干擾,本研究采用不同色譜方法進行雙定位并利用陰性樣品去除本底。將兩次色譜方法下定位提取的質(zhì)譜信息進行交叉匹配,最終獲得了疑似目標化合物即角黃素的精確質(zhì)量數(shù)和分子式,提高了化合物的鑒定效率。

3 結論

本研究建立了一種快速鑒定中華鱉中未知著色劑的LC-Q-TOF MS分析方法,并從實際樣品中成功篩查出未知著色劑為角黃素。該方法結合軟件信息學優(yōu)勢,具有效率高、準確度高的特點。該研究思路對其他基質(zhì)中未知化合物的鑒定分析工作提供了參考意義。由于僅僅采用了LC-MS手段進行鑒定,因此該策略對于情況更為復雜的化合物信息推斷存在一定的局限性,這就需要通過其他技術手段(如核磁共振譜和紅外光譜等)來進一步對未知化合物進行確證分析。

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Rapid screening and confirmation of non-target pigment in Chinese softshell turtle by liquid chromatography coupled to time of flight mass spectrometry

LI Shiyan1, WANG Yang1, ZHOU Fan1, ZHENG Chongying1,ZHANG Haiqi1, HE Zhongyang1*, HE Xin2

(1.AquaticProductsQualityInspectionCenterofZhejiangProvince,Hangzhou310023,China;2.SchoolofFoodScienceandBiotechnology,ZhejiangGongshangUniversity,Hangzhou310035,China)

A method of non-target pigment screening in Chinese softshell turtle has been established by using liquid chromatography coupled to time of flight mass spectrometry (LC-Q-TOF MS). After being purified by a simple acetonitrile extraction work, the non-target pigment in 20 Chinese softshell turtle samples was detected by liquid chromatography-photodiode array detection (LC-DAD). The S7 sample, which has a strong spectral response, was chosen to extract the mass spectrometry information of the non-target pigment on different gradient elution conditions. In order to get the characteristic molecular mass ion (564.397 73 Da and 564.395 61 Da) of the non-target pigment, qualitative spectral full scan with negative sample was used. The molecular formula generation data and the literature information prompted speculation that the non-target pigment was canthaxanthin with the formula of C40H52O2. By comparing the canthaxanthin standard material MS/MS information, the result was confirmed accurate. A strategy of LC-Q-TOF MS method for the qualitative analysis of unknown compounds is discussed, and the results indicated that the described method can be effectively applied to qualitative analysis for non-target pigment in Chinese softshell turtle.

liquid chromatography-quadrupole time of fight mass spectrometry (LC-Q-TOF MS); non-target compound identification; pigment; Chinese softshell turtle

10.3724/SP.J.1123.2015.08008

浙江省科技廳公益技術研究農(nóng)業(yè)項目(2013C32062,2015C32029);浙江省自然科學基金項目(LQ14C190001);2013年浙江省農(nóng)業(yè)標準化研究項目.

2015-08-09

O658

A

1000-8713(2015)12-1251-06

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:hzyzjsc@163.com.