山羊痘疫苗熒光定量效檢方法的建立及應(yīng)用

張倩,唐娜,2,王金良,2,苗立中,2,胡琳琳,孫翠萍,沈志強(qiáng),2*

1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州256600

2.濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州256600

山羊痘疫苗熒光定量效檢方法的建立及應(yīng)用

張倩1,唐娜1,2,王金良1,2,苗立中1,2,胡琳琳1,孫翠萍1,沈志強(qiáng)1,2*

1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州256600

2.濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州256600

為建立靈敏度高，特異性強(qiáng)的山羊痘（GPV）熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)方法，并以穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品替代定量測(cè)定山羊痘疫苗半成品中的核酸。針對(duì)山羊痘病毒基因組P32基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，構(gòu)建穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行敏感性、特異性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，并對(duì)本單位的部分批次山羊痘疫苗半成品進(jìn)行定量檢驗(yàn)，與TCID50效檢結(jié)果相比較尋求相關(guān)性。結(jié)果表明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.9995，擴(kuò)增效率為98%，該方法只擴(kuò)增山羊痘病毒，不擴(kuò)增其他病原，能檢測(cè)到每微升體積中100個(gè)DNA模板拷貝數(shù)，比山羊痘普通PCR(GPV-nPCR)高一個(gè)數(shù)量級(jí)。制備三批標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果變異系數(shù)在0.43～1.9%之間，穩(wěn)定性良好。對(duì)4批的山羊痘疫苗半成品進(jìn)行效力檢驗(yàn)，TCID50≥104.5/mL時(shí)Ct值為14.51。建立的GPV-FQ-PCR方法能特異性的檢測(cè)GPV核酸含量，與TCID50測(cè)定的結(jié)果具有良好的相關(guān)性，可用于山羊痘半成品中核酸的定量測(cè)定。

山羊痘;疫苗;熒光定量;效力檢驗(yàn)

山羊痘病毒（Goat pox virus，GPV)、綿羊痘病毒（Sheep pox virus,SPV）和疙瘩皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)同屬于羊痘病毒屬，山羊痘主要癥狀是皮膚和粘膜上出現(xiàn)痘疹和痘皰。該病的流行已有很長(zhǎng)的歷史，主要分布于非洲、中東及中亞地區(qū)，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)危害嚴(yán)重。該病發(fā)病迅速，羔羊死亡率高。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疾病[1]。

熒光定量PCR（Fluorescent quantitation PCR,FQ-PCR）是在普通PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來，熒光定量PCR相比于普通PCR具有更高靈敏度，并可精確定量，因此被廣泛的用于疾病的早期檢測(cè)和臨床組織樣品的定量檢測(cè)[2]。近年來因其可精確定量還被應(yīng)用于替代疫苗半成品的效力檢驗(yàn)，2006年蔣春燕等建立熒光定量PCR與豬瘟兔化弱毒苗的半成品的效力檢驗(yàn)兔體定型熱反應(yīng)相比較，建立的熒光定量檢測(cè)方法與兔體定型反應(yīng)熱之間具有很好的相關(guān)性[3]，可用以豬瘟兔化弱毒苗的半成品的效力檢驗(yàn)。2013年陳鍇等針對(duì)豬瘟兔化弱毒的3’端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了MGB探針熒光定量法，靈敏度更高，結(jié)果同樣適用于豬瘟兔化弱毒苗的半成品中豬瘟兔化弱毒的定量檢測(cè)[4]。

山羊痘目前的預(yù)防措施主要是免疫山羊痘弱毒疫苗進(jìn)行保護(hù)，山羊痘AV41是目前國(guó)內(nèi)主要的預(yù)防山羊痘的疫苗，在山羊痘的防控中發(fā)揮了重要的作用[5]。目前該疫苗的生產(chǎn)主要采用了原代綿羊羔睪丸細(xì)胞（Sheep testicular cells,STCs）[6]。同時(shí)也利用STCs進(jìn)行效力檢驗(yàn)。但是該原代細(xì)胞制備成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，并且受綿羊羔個(gè)體差異的影響而對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響。

本研究研究針對(duì)山羊痘病毒P32基因建立了SYBGREENⅠ熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法，構(gòu)建穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品，以利用其敏感性高，特異性好，檢測(cè)成本低的特點(diǎn)，對(duì)疫苗半成品進(jìn)行的效力檢驗(yàn)。即可節(jié)約檢測(cè)成本，縮短檢測(cè)時(shí)間，提供快速準(zhǔn)確的結(jié)果。同時(shí)該方法也可應(yīng)用于山羊痘的早期診斷，為監(jiān)測(cè)疫情的發(fā)展提供靈敏可靠的方法。

1 材料和方法

1.1 毒株,菌種和載體

山羊痘弱毒株病毒AV41由山東綠都生物可以有限公司提供；羊口瘡，羊胸膜肺炎病料由山東綠都生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器與試劑

SYBR Premix Ex TaqTM（PerfeCt Real Time）試劑盒、PrimeScript RT reagent試劑盒、Ex Taq聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1）、6×Loading Buffer、PMD-18T克隆試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、多功能DNA純化回收試劑盒、DH5a購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；病毒RNA/DNA抽提試劑盒購(gòu)自AXYGEN。

熒光定量PCR儀LightCycler?480購(gòu)自羅氏；微量紫外分光光度計(jì)Nanodrop 2000/2000C購(gòu)自賽默飛世爾科技；普通PCR儀T100型梯度PCR儀購(gòu)自伯樂。

1.3 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank登錄的GPVHuB/2009/China株的膜蛋白p32基因(JN596275.1)序列，應(yīng)用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物P1:5'-GCAA ATCGTATGCCGATGC-3'；下游引物P2:5'-CCGTCAGGAAATCtATGAGCC-3'，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為4 94 bp,用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；熒光定量PCR引物R1:5'-CtCAAACtGGTAGAAATACCtTTAT-3'；R2:5'-GGATATGATTTTACCtTATCtGC-3'。產(chǎn)物長(zhǎng)度為110 bp。

1.4 樣品處理與核酸提取

將凍干毒種樣品用無(wú)菌的生理鹽水稀釋至原體積，12000 r/min離心5 min，取200μL上清液，利用病毒RNA/DNA抽提試劑盒提取病毒核酸。

1.5 目的基因的擴(kuò)增與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

以提取的山羊痘疫苗的DNA作為模板使用設(shè)計(jì)的引物P1、P2擴(kuò)增目的基因片段。擴(kuò)增體系：2×Premix Taq 10 μL、上下游引物（10 μM）各1 μL、DNA模板2 μL、滅菌雙蒸水6 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定。膠回收目的片段用以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。挑取菌落篩選陽(yáng)性克隆，用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的濃度與純度，送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank序列進(jìn)行比對(duì)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性檢測(cè)

根據(jù)重組質(zhì)粒的濃度，計(jì)算拷貝數(shù)濃度。計(jì)算公式為拷貝數(shù)=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)。將上述制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品10倍倍比稀釋后，取1.0×102～1.0×108拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別進(jìn)行熒光定量PCR和普通PCR，比較兩種方法的靈敏度。

1.7 特異性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別以山羊常見病山羊痘、羊口瘡、羊傳染性胸膜肺炎DNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)以驗(yàn)證該方法的特異性。

根據(jù)敏感性試驗(yàn)的擴(kuò)增動(dòng)力曲線選取擴(kuò)增效率高的六個(gè)稀釋梯度，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，制備三批標(biāo)準(zhǔn)品，將質(zhì)粒的濃度稀釋到同樣濃度進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)，比較建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性。

1.8 在疫苗半成品效力檢驗(yàn)中的應(yīng)用及在臨床診斷上的應(yīng)用

利用建立的山羊痘熒光定量方法，對(duì)四批已知病毒滴度的疫苗半成品進(jìn)行提取病毒基因組后進(jìn)行病毒含量檢測(cè)，與TCID50方法結(jié)果比對(duì)，分析結(jié)果的相關(guān)性。

利用建立的熒光定量的方法，對(duì)本公司新引進(jìn)的山羊進(jìn)行山羊痘篩選，無(wú)明顯病變特征的羊采集口鼻粘液作為組織樣本，出現(xiàn)疑似皮膚痘腫的同時(shí)采集皮膚組織及口鼻粘液，利用試劑盒提取組織樣本中提取病毒基因組，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定，與預(yù)期的目的條帶相一致（如圖1）。將目的片段與載體重組后，進(jìn)行鑒定篩選陽(yáng)性克隆，酶切后目的條帶的大小與預(yù)期的一致。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序后與Genbank中公布的GPV基因序列進(jìn)行同源性比較，其核苷酸同源性在99%以上，表明重組質(zhì)粒序列正確。經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度為175.36 ng/μL，依據(jù)基因拷貝數(shù)計(jì)算公式（基因拷貝數(shù)=DNA質(zhì)量濃度/DNA分子量）測(cè)得質(zhì)?？截悢?shù)為個(gè)5.3x1010拷貝/μL。

圖1 GPV基因擴(kuò)增M:DL2000DNA;1:陰性對(duì)照組;2目的基因Fig.1 PCR amplification of GPVM:DL2000DNA;1:Negative control;2:Target gene

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性檢測(cè)

用TE將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組質(zhì)粒首先進(jìn)行530倍的稀釋，稀釋終濃度為108拷貝/μL，然后進(jìn)行10倍的倍比稀釋，取102～108拷貝/μL的7個(gè)稀釋梯度作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，生成動(dòng)力學(xué)曲線（圖2)和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），Ct值和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，動(dòng)力學(xué)曲線的擴(kuò)增效率為98%，

標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.3693，線性方程為y=-3.3693x+34.349，相關(guān)系數(shù)為0.9995（圖3）。溶解曲線倒數(shù)圖中（圖4）有單一清晰的峰，引物擴(kuò)增特異性好無(wú)引物二聚體等非特異性擴(kuò)增片段。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒倍比稀釋擴(kuò)增動(dòng)力曲線Fig.2 Dynamic amplification curves of standard plasmid dilution1-7:依次為倍比稀釋質(zhì)粒濃度108～102拷貝/μL1-7:The curves 1 to 7 represent the plasmid concentration 108～102copy/μL diluted in double

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸分析Fig.3 Linear regression analysis of the standard curve

圖4 溶解曲線Fig.4 Dissolution curve

圖5 普通PCR凝膠電泳鑒定結(jié)果Fig.5 Agarose gel eletrophoresis result of common PCR1-7:依次為倍比稀釋質(zhì)粒濃度108～102/μL1-7:The curves 1 to 7 represent the plasmid concentration 108～102copy/μL diluted in double

將10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行了普通PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果見圖5。結(jié)果表明GPV-nPCR檢測(cè)到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悵舛葹?000拷貝/μL為最低的檢測(cè)度，而圖2結(jié)果表明GPV-FQ-PCR的檢測(cè)到的質(zhì)?？截悵舛葹?00拷貝/μL。熒光定量的靈敏度優(yōu)于普通PCR。

2.4 特異性試驗(yàn)與穩(wěn)定性試驗(yàn)

山羊痘、羊口瘡，羊傳染性胸膜肺炎DNA作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除山羊痘能夠擴(kuò)增出S型動(dòng)力曲線，其它病毒均不擴(kuò)增。溶解曲線無(wú)非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的峰值出現(xiàn)，表明所建立的方法具有很好的特異性（圖6），與其它山羊常見病原核酸無(wú)交叉反應(yīng)。

圖6 特異性檢測(cè)擴(kuò)增曲線Fig.6 The specific experiment of FQ-PCR assay

選取擴(kuò)增效率高的六個(gè)稀釋梯度，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，制備三批標(biāo)準(zhǔn)品BZ1、BZ2、BZ3，將三批標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度稀釋到同樣濃度進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)，比較建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的穩(wěn)定性。表1的結(jié)果表明三批標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的變異系數(shù)在0.43～1.90%之間，表明我們建立的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性好，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定（表1）。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Test results of standard stability

2.5 在疫苗半成品中的效價(jià)監(jiān)測(cè)上的應(yīng)用及在臨床診斷上的應(yīng)用

利用建立的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)四批山羊痘半成品進(jìn)行檢測(cè)并與TCID50的結(jié)果相比較，TCID50≥104.5時(shí)判定為合格，檢測(cè)結(jié)果表明GPV01為最低合格標(biāo)準(zhǔn)，其病毒含量為7.93×105(表2)。

表2 山羊痘半成品效力檢測(cè)Table 2 Efficacy test of GPV semi-finished products

臨床早期診斷，對(duì)新引入的羊群篩選，其中兩只疑似皮膚痘腫的山羊均檢測(cè)為山羊痘陽(yáng)性，三份鼻腔粘液檢測(cè)為陽(yáng)性，痘腫皮膚與鼻腔粘液檢測(cè)結(jié)果相符合，將皮膚無(wú)痘腫，鼻腔粘液檢測(cè)為陽(yáng)性的山羊隔離，該羊三天后皮膚出現(xiàn)痘腫，檢測(cè)普通PCR檢測(cè)為陽(yáng)性。

3 討論

熒光定量PCR是20世紀(jì)90年代美國(guó)AppLied Bisosystems公司率先推出的的一種新型的核酸定量技術(shù)，與普通PCR相比其直觀性強(qiáng)，可以監(jiān)督整個(gè)反應(yīng)，又因其特異性強(qiáng)、敏感性好、精確性高被廣泛的用于疾病的診斷、基因的監(jiān)測(cè)、免疫分析等多個(gè)領(lǐng)域[7,8]。

山羊痘的疫苗的效力檢測(cè)用細(xì)胞為綿羊羔睪丸原代細(xì)胞，該細(xì)胞獲得難度大成本高，并且細(xì)胞活力受山羊的體重、月齡等因素影響致使效力檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，不能對(duì)病毒的毒價(jià)進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。近年來熒光定量技術(shù)因其可精確定量的特點(diǎn)被用以疫苗半成品的效力檢驗(yàn)，韓劍鋒等建立H5亞型禽流感病毒滅活疫苗中病毒核酸的定量檢測(cè)方法,分析其與HI抗體效價(jià)之間的相關(guān)性，探索禽流感滅活疫苗效力體外檢驗(yàn)的方法[9]。陳鍇等建立的熒光定量檢測(cè)方法以替代豬瘟兔化弱毒苗的傳統(tǒng)效力檢驗(yàn)，快速準(zhǔn)確的對(duì)疫苗半成品進(jìn)行定量[4]。本研究將熒光定量的檢測(cè)結(jié)果與細(xì)胞效力檢測(cè)結(jié)果相比較，建立穩(wěn)定的相關(guān)性，使其替代傳統(tǒng)的檢測(cè)方式，對(duì)疫苗半成品進(jìn)行效力檢測(cè)，可快速的淘汰不合格產(chǎn)品，降低檢測(cè)成本。我們檢測(cè)本次合格的檢測(cè)Ct值為14.51，這與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為106拷貝數(shù)/μL時(shí)的Ct值相近，為了避免因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品不同批次間產(chǎn)生的誤差，我們定為每次檢測(cè)的半成品的Ct值≥106拷貝數(shù)/μL標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，即判為合格，若是小于該值時(shí)，則需通過TCID50進(jìn)行復(fù)核效檢。

羊痘病毒屬的成員之間的基因的同源性高達(dá)96%，血清學(xué)無(wú)明顯的交叉反應(yīng)，三種病毒的劃分主要是依據(jù)易感宿主劃分[10]，本研究針對(duì)山羊痘病毒P32基因設(shè)計(jì)熒光定量PCR方法可同時(shí)用于該病毒屬的臨床診斷。程振濤等從利用探針法比臨床診斷提早5 d從鼻腔分泌液中檢測(cè)到了病毒粒子[11]。我們從新引入羊場(chǎng)的羊群中采集鼻腔粘液進(jìn)行山羊痘篩選，同時(shí)對(duì)出現(xiàn)疑似皮膚痘腫的進(jìn)行組織采集，兩只疑似皮膚痘腫的山羊均檢測(cè)為山羊痘陽(yáng)性，鼻腔粘液檢測(cè)均為陽(yáng)性，該羊與羊群隔離后三天出現(xiàn)皮膚痘腫。結(jié)果表明本研究建立的熒光定量PCR作為羊痘的早期診斷，用于臨床的疾病快速篩選。

4 結(jié)論

本研究成功建立了山羊痘熒光定量檢測(cè)方法，即可用于疫苗半成品中病毒的精確定量用以替代半成品效力檢驗(yàn)，同時(shí)也可用于臨床山羊痘的早期診斷，及早確診患病羊及時(shí)隔離建立健康羊群，為山羊痘疫病的控制提供重要的檢測(cè)手段。

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Establishment and Application of Fluorescent Quantitation Efficacy Test for Vaccine of Goat Pox Virus

ZHANG Qian1,TANG Na1,2,WANG Jin-liang1,2,MIAO Li-zhong2,HU Lin-lin1, SUN Cui-ping1,SHEN Zhi-qiang1,2*
1.Shandong Lvdu Bio-Science&Technology Co.Ltd,Binzhou256600,China
2.Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy,Binzhou256600,China

To establish a sensitive and specific fluorescent quantitation PCR(FQ-PCR)determination method for goat pox virus(GPV)and to find a stable measurement standard sample as an alternative for efficacy test.A pair of primers was designed for GPV P32 gene to construct the standard plasma and test for sensitivity,specificity and stability.GPV-FQ-PCR was applied to detect semi-finished products of the vaccine and to compare with TCID50.The results showed that correlation coefficient of the standard curve was 0.9995,the amplification efficiency was 98%.The method only amplified goat pox viruses rather than other pathogens.The least copy number of high sensitivity detection in the template DNA was 100/μL. Three batches of standard samples were used in preparation.Variation coefficients were very stable between 0.43-1.9%.Ct value was 14.51 when TCID50≥104.5/mL in four batches of goat pox vaccine semi-finished products test.Established GPV-FQ-PCR method specifically detects nucleic acid of GPV,there is a correlation with the results of TCID50and could be used for semi-finished products efficacy test of GPV vaccine.

GPV;vaccine;fluorescent quantitation PCR(FQ-PCR);efficacy test

S8

:A

:1000-2324(2015)06-0865-05

2013-10-17

:2013-12-04

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系羊創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(SDAIT09-011-07)

張倩(1984-),女,碩士,主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué).E-mail:zqnew.shd@163.com

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