規(guī)?；怆u場(chǎng)常見(jiàn)呼吸道病原體感染狀況調(diào)查

朱明霞,牛玉娟,馬海營(yíng),呂傳位,張清林,劉思當(dāng)*

1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東聊城252059

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東泰安271000

3.泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山東泰安271000

規(guī)?；怆u場(chǎng)常見(jiàn)呼吸道病原體感染狀況調(diào)查

朱明霞1,牛玉娟2,馬海營(yíng)2,呂傳位2,張清林3,劉思當(dāng)2*

1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東聊城252059

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東泰安271000

3.泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山東泰安271000

呼吸道疾病尤其是常見(jiàn)的禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎是危害養(yǎng)雞業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一。為了解肉雞初期呼吸道病病原體的感染狀況，從2萬(wàn)孵化的雞胚中采集了210枚弱、死胚樣品及5日齡有呼吸道癥狀的48只病死雞。用RT-PCR方法對(duì)這兩批樣品進(jìn)行了H9N2亞型禽流感病毒(H9N2AIV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒（IBV）感染狀況的檢測(cè)，又將5日齡的雛雞進(jìn)行了大腸桿菌（Escherichia coli）及沙門(mén)氏菌（Salmonellaspp.）分離鑒定，分析檢出率。結(jié)果表明，在210枚雞胚樣品中H9N2 AIV、NDV和IBV的檢出率分別為3.81%，21.9%和23.8%，弱、死胚樣品常見(jiàn)呼吸道病病毒感染率高達(dá)49.51%。5日齡雛雞樣品中H9N2AIV、NDV、IBV、E.coli和S.spp.的檢出率分別為45.8%，37.5%、10.4%、54.2%和8.3%，未發(fā)現(xiàn)3種病毒共感染的現(xiàn)象，但是病毒與細(xì)菌的共感染率達(dá)58.3%，主要是大腸桿菌與病毒的雙重感染。呼吸道病毒一般能將雞胚在孵化過(guò)程中致死，但若含病毒的雞胚沒(méi)能死亡，雛雞出殼后發(fā)育到一定時(shí)期（母源抗體衰竭后）所含病毒會(huì)大量復(fù)制，進(jìn)而發(fā)生相應(yīng)的呼吸道疾病，在雞群中迅速傳播，并繼發(fā)其他細(xì)菌性疾病，造成雞群大批死亡，這是肉雞中后期呼吸道疾病日益嚴(yán)重的重要原因。

肉雞;雞胚;呼吸道病原;感染;PCR

肉雞呼吸道疾病屬多病因呼吸道病綜合征，常造成肉雞養(yǎng)殖的嚴(yán)重?fù)p失，死淘率可達(dá)30%以上，并造成發(fā)病雞生長(zhǎng)遲緩、胴體降級(jí)或廢棄，而成為危害肉雞養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病[1,2]。肉雞呼吸道病病因極為復(fù)雜[3-5]，既有水平傳播性疾病，也有垂直傳播性疾病，常見(jiàn)的有H9N2亞型禽流感病毒(H9N2AIV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門(mén)氏菌（Salmonellaspp.）等，其中3種病毒是否能經(jīng)卵垂直傳播尚存在爭(zhēng)議[6,7]。本研究從山東某大型肉雞養(yǎng)殖公司的210枚弱、死雞胚及48只雛雞樣品中，用PT-PCR和細(xì)菌分離鑒定方法檢測(cè)5種病原的感染率，以期為商品肉雞呼吸道病的病原學(xué)分析及防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

210枚弱、死雞胚和48只5日齡淘汰弱死雛雞樣品，采自山東省某大型肉雞養(yǎng)殖集團(tuán)公司；9日齡SPF雞胚購(gòu)自濟(jì)南家禽所。

1.2 試劑

Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；rTaq DNA聚合酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑、DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、EDTA、瓊脂糖，購(gòu)自Sigma公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、革蘭染色液；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 病料的處理無(wú)菌采取雛雞的肝臟、肺臟及弱、死胚的肺臟，將肺臟分別在滅菌的乳缽內(nèi)充分研磨，用滅菌生理鹽水制成1:3乳劑，4℃條件下5000 r/min離心5 min，取上清液，加入2000 IU/mL青霉素、鏈霉素。反復(fù)凍融3次，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 雞胚接種上述病料經(jīng)尿囊腔接種9日齡雞胚，0.2 mL/枚，另設(shè)陰性對(duì)照。棄除24 h內(nèi)死亡胚，觀察3～5 d，每天記錄結(jié)果，收取24 h后死亡胚的尿囊液，于-80℃冷凍保存、備用。

1.3.3 病毒RNA的提取250 μL雞胚尿囊液中加入750 μL Trizol，劇烈震蕩1 min，室溫靜置5 min；向上述體系中加入300 μL氯仿，劇烈振蕩1 min，室溫靜置3 min；12000 r/min，4℃離心15 min；取上清（約500 μL）置于一個(gè)新的DEPC處理過(guò)的1.5 mL離心管中，加入500 μL異丙醇，混勻后室溫沉淀30 min；12000 r/min，4℃離心15 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀物，12000 r/min，4℃離心10 min；棄上清，室溫空干后加入30 μL DEPC水溶解沉淀。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 細(xì)菌分離鑒定將48份肝臟分別無(wú)菌勾取接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中37℃增菌16 h，再將增菌肉湯分別劃線接種于伊紅美藍(lán)和SS營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，挑取單個(gè)可疑菌落涂片革蘭氏染色鏡檢。

1.4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Gen bank已發(fā)布的H9N2AIV、NDV和IBV的序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)特異性引物（表1），分別用于檢測(cè)。引物由上海生工公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.4.2 RT-PCR擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄(RT)的反應(yīng)體系為10 μL：RNA懸浮液5 μL，加入1 μL隨機(jī)引物，混合后于70℃溫浴10 min后，置冰上2 min，依次加入5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，RNA酶抑制劑0.25 μL，dNTP混合物0.5 μL，5×反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，最后加水0.75 μL，混勻后于42℃水浴1 h，70℃于溫浴15 min后，置冰上冷卻，得到cDNA。用制備的cDNA進(jìn)行PCR，采用25 μL PCR體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA3 μL,10×ExTaq反應(yīng)緩沖液2.5 μL，dNTP混合物2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，滅菌雙蒸水15 μL，混勻，加入ExTaq DNA聚合酶0.5 μL，經(jīng)94℃5 min預(yù)變性后進(jìn)行PCR循環(huán)，ND和IB的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min；H9的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30 s，59℃30 s，72℃90 s,35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 肉雞初期5種呼吸道病病原體的感染情況

由表2雞胚樣品中H9N2AIV、NDV和IBV3種病原體的檢測(cè)結(jié)果可以看出，210枚弱、死胚樣品中IBV的檢出率最高為23.8%，H9N2的檢出率最低為3.81%，NDV的檢出率為21.9%。未檢測(cè)到共感染現(xiàn)象，弱、死胚樣品常見(jiàn)呼吸道病病毒感染率高達(dá)49.51%。圖1為部分樣品的PCR凝膠電泳圖。

由表3雛雞樣品中5種病原的檢測(cè)結(jié)果分析，大腸桿菌的檢出率最高54.2%，其次H9N2為45.8%，NDV、IBV和S.spp.的檢出率分別為37.5%、10.4%和8.3%。單獨(dú)感染一種細(xì)菌和三重感染的樣品未檢測(cè)出，單獨(dú)感染H9N2、NDV和IBV比例分別是10.4%、12.5%和4.17%，兩種細(xì)菌均是與病毒形成雙重感染，以H9N2+E.coli和NDV+E.coli最為常見(jiàn)，感染比例為31.25%、20.8%。

表2 雞胚中3種呼吸道病原體的感染結(jié)果Table 2 Results of the detection rate of infection of three pathogens from embryonated eggs

表3 雛雞5種呼吸道病原體的感染結(jié)果Table 3 Results of the detection rate of infection of five pathogens from broilers

圖1 雞胚中3種病原PCR凝膠電泳部分結(jié)果M:2000 bp Mark；Y:陽(yáng)性對(duì)照；-:陰性對(duì)照Fig.1 Detection result of three respiratory pathogens of some samples by PCRM:2000 bp Mark;Y:Positive control;-:Negative control

3 討論

本研究對(duì)210枚弱、死肉雞胚和5日齡雛雞進(jìn)行了H9N2 AIV、NDV、IBV、E.coli和S.spp.的感染情況調(diào)查，結(jié)果顯示：雞胚中存在較高比例的3種病毒性呼吸道病原單獨(dú)感染的情況，但未檢測(cè)到共感現(xiàn)象；5日齡的雛雞中E.coli感染尤為嚴(yán)重，均與NDV和H9N2AIV混合感染。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已證實(shí)，雞首先單獨(dú)感染了H9N2、NDV或IBV后，會(huì)為細(xì)菌性或病毒性病原體的入侵創(chuàng)造條件：大腸桿菌、雞毒支原體、波氏桿菌等是最常見(jiàn)的繼發(fā)感染菌且常造成慢性和持續(xù)性的感染[8-11]；受到感染的雞體抵抗力下降，已侵入機(jī)體的病毒毒力會(huì)顯著增強(qiáng)且在雞群中迅速傳播[12]。因此，雞胚中攜帶高比例的H9N2、NDV和IBV應(yīng)引起我們的高度重視。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到弱、死雞胚中H9N2 AIV的分離率（3.81%）較低，而5日齡的弱死雛雞分離率（45.8%）極高，分析主要是源于環(huán)境污染，因此鑒于禽流感對(duì)我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的重大威脅以及公共衛(wèi)生考量，所以還是要定期進(jìn)行免疫效果檢測(cè)，及時(shí)調(diào)整免疫程序，以有效防止該病的發(fā)生流行，即使是低致病性禽流感也應(yīng)引起我們的高度重視。另外雞胚和雛雞中檢出NDV的比率相差不大，說(shuō)明胚中有較高比例的病毒感染率，這將對(duì)孵出的雛雞具有很大的危險(xiǎn)性，該類(lèi)病毒傳染性強(qiáng)，可導(dǎo)致其他健康的雛雞感染，在受到應(yīng)激或其他不良因素刺激作用時(shí)，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的繼發(fā)性細(xì)菌病或病毒病，從而造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，不同呼吸道病原體感染是目前商品肉雞呼吸道疾病的基本特征，雛雞攜帶病毒對(duì)肉雞呼吸道疾病發(fā)生有著不可推卸的責(zé)任。從雞胚攜帶病毒的檢測(cè)結(jié)果可以推測(cè)種雞場(chǎng)肯定也存在較為嚴(yán)重的H9N2、NDV和IBV的感染，3種病毒可以通過(guò)水平傳播在雞群中擴(kuò)散，造成大規(guī)模的種雞感染，由于種雞群均對(duì)上述3種疾病采取高密度免疫，抗體水平較高，多呈隱性感染狀態(tài)，對(duì)商品肉雞養(yǎng)殖構(gòu)成了重大的潛在威脅。

實(shí)踐表明，降低雞苗帶毒率是商品肉雞呼吸道病防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，做好種雞的免疫、凈化工作是防止雞苗帶毒的有效措施；做好種苗的引種檢疫、搞好日常飼養(yǎng)管理、健全生物安全體系以及平時(shí)做好疾病監(jiān)測(cè)評(píng)估是種雞健康養(yǎng)殖的綜合措施。及時(shí)淘汰患病種雞，必要時(shí)采取種雞凈化措施，淘汰隱性帶毒種雞，另外，要做好種蛋的及時(shí)消毒處理。商品肉雞場(chǎng)要購(gòu)買(mǎi)健康雞苗，加強(qiáng)雞苗的帶毒監(jiān)測(cè)，堅(jiān)持使用正規(guī)廠家疫苗，科學(xué)制定疫苗免疫程序，防止養(yǎng)殖環(huán)境的病原污染，減少雞群的應(yīng)激危害因素，最大限度的降低呼吸道病的發(fā)病率。

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Epidemic Investigation for the Infection Avian Respiratory Disease Pathogens from a Large-scale Chicken Farm

ZHU Ming-xia1,NIU Yu-juan2,MA Hai-ying2,LV Chuan-wei2,ZHANG Qingl-lin3, LIU Si-dang2*
1.Agricultural College of Liaocheng University,Liaocheng252059,China
2.College of Animal Science and Technology/Shandong Agricultural University,Tai’an271000,China
3.Taishan Institute of Technology,Tai’an271000,China

Avian respiratory infection plays a prominent role in damaging the poultry industry,especially the Avian flu, Newcastle disease and chicken infectious bronchitis.210 lung samples of dead or weak broiler embryo and 48 lung and liver samples of broilers with respiratory symptoms were collected from a large-scale broiler farm,and then RT-PCR was used to detect H9N2 subtype of Avian influenza virus(H9N2 AIV),Newcastle disease virus(NDV)and infectious bronchitis virus (IBV),Escherichia coliandSalmonellaspp.were separated from 48 chicks.The results show that the detection rates of the three pathogens of the 210 lung samples of embryo were 3.81%(H9N2 AIV),21.9%(NDV),23.8%(IBV)and respiratory tract viral infection rates were up to 49.51%.The detection rates of the five pathogens of the 48 lung and liver samples of broilers were 45.8%(H9N2 AIV),37.5%(NDV),10.4%(IBV),E.coli(54.2%),S.spp.(8.3%)and the co-infection of the three virus were not detected,while the ratio of co-infection between virus and bacteria was up to 58.3%especiallyE.coliplayed an important role in the co-infection.The chicken embryos were easier to die during incubation with respiratory viral, but if not die the chicks developed to a certain period(the maternal antibody failure)while the virus could proliferation then respiratory diseases would happen and spread rapidly in chicken flocks with bacterial infection resulted in a large number of deaths,which is an important cause of late respiratory illness increasingly serious in broiler chickens.

Chicken;chick embryo;respiratory tract pathogen;infection;PCR

S852.35

:A

:1000-2324(2015)06-0861-04

2014-08-11

:2014-08-20

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J14LF03)

朱明霞(1978-),女,山東茌平,副教授,研究方向家禽疫病發(fā)生機(jī)理與防控.Email:1538054669@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:liusid@sdau.edu.cn