桃自然休眠期間抗氧化系統(tǒng)酶(CAT、POD、SOD)活性變化

朱翠英,付喜玲,孫明岳,陳修德,肖偉,李玲

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安271018

桃自然休眠期間抗氧化系統(tǒng)酶(CAT、POD、SOD)活性變化

朱翠英,付喜玲,孫明岳,陳修德,肖偉,李玲*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安271018

本文以曙光油桃為試材，分析了休眠期花芽和葉芽中抗氧化系統(tǒng)酶類(lèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性動(dòng)態(tài)以及低溫（5℃）、高溫（20℃）處理對(duì)三種酶的活性影響。結(jié)果表明：CAT、POD、SOD酶活性變化動(dòng)態(tài)不同，CAT活性休眠初期較低，之后迅速上升，自然休眠結(jié)束后急劇下降；POD活性前期較低，而后一直升高，試驗(yàn)期內(nèi)并無(wú)降低；SOD活性則是休眠前期較高，低溫來(lái)臨后降低，并維持較低的活性水平，休眠結(jié)束后略有回升。休眠期三種酶活性均是花芽高于葉芽。低溫、高溫處理對(duì)酶活性影響效應(yīng)不同。5℃恒低溫處理使CAT、POD活性升高，使SOD活性降低；20℃恒高溫處理的效應(yīng)則相反。

桃樹(shù);自然休眠;CAT;POD;SOD

自然休眠是落葉果樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育不可逾越的階段，是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一種生長(zhǎng)暫?，F(xiàn)象，是受多種環(huán)境因素影響和多基因控制的典型的數(shù)量性狀，涉及到一系列生理生化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)問(wèn)題。許多研究表明呼吸代謝和活性氧代謝在休眠解除過(guò)程中都發(fā)生標(biāo)志性變化，雖然目前仍沒(méi)有直接證據(jù)證明活性氧代謝參與芽自然休眠解除的調(diào)控，但許多研究都表明活性氧代謝與芽休眠過(guò)程存在密切聯(lián)系[1,2]。另外抗氧化系統(tǒng)酶作為保護(hù)酶，在休眠解除中發(fā)揮了一定作用[1,3,4]。國(guó)外對(duì)自然休眠解除過(guò)程中抗氧化系統(tǒng)的變化研究認(rèn)為，活化的抗氧化系統(tǒng)能夠清除氧自由基，與H2O2物質(zhì)密切關(guān)聯(lián)的三種酶過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性上升，非酶促系統(tǒng)中抗壞血酸、還原型谷胱甘肽等物質(zhì)含量增加，是果樹(shù)解除休眠的重要原因[5-7]，但缺乏抗氧化系統(tǒng)在自然休眠過(guò)程中的動(dòng)態(tài)分析。落葉果樹(shù)可受多種因子誘導(dǎo)進(jìn)入休眠期[8-11]，包括光周期、低溫、干旱等。自然休眠結(jié)束的時(shí)期理論上是設(shè)施果樹(shù)扣棚升溫的最早時(shí)間[12]，對(duì)自然休眠進(jìn)程調(diào)控是目前果樹(shù)設(shè)施栽培中亟待解決的問(wèn)題。本研究以設(shè)施栽培中常用的油桃品種‘曙光’為試材，對(duì)自然休眠進(jìn)程中三種酶活性動(dòng)態(tài)及低溫、高溫對(duì)酶活性的影響效應(yīng)作分析，旨在探討抗氧化系統(tǒng)變化在自然休眠中的作用，為自然休眠的微域調(diào)控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2013～2014年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施果樹(shù)示范園進(jìn)行。試材為五年生曙光品種（Prunuspersicavar.nectarinacv.Shuguang），砧木為青州蜜桃，生長(zhǎng)健壯，常規(guī)管理。

自2013年10月20日始，采集生長(zhǎng)一致、長(zhǎng)度30～40 cm，角度平斜的一年生花枝，分別取花芽、葉芽，去掉鱗片，作CAT、POD、SOD活性動(dòng)態(tài)分析。每隔10 d取樣1次，共取樣10次。

于2013年11月10日取一年生花枝，捆綁成束，每束10條為一重復(fù)，每處理重復(fù)6次。枝條放在盛有少許清水的燒杯中，分別同時(shí)置于兩個(gè)光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于5℃、光/暗14/10 h、光強(qiáng)1200 μmol·m-2·s-1；20℃、光/暗14/10 h、光強(qiáng)1200 μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)；以露天自然生長(zhǎng)的同一品種為對(duì)照（CK）。自處理之日始，每隔2 d取樣，測(cè)定花芽的CAT、POD、SOD酶活性，共測(cè)定6次。過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定按《植物生理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)》[13]的方法進(jìn)行。過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定按孫文全[14]方法進(jìn)行。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定按張志良[15]方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然休眠期CAT、POD、SOD活性變化動(dòng)態(tài)

2.1.1 自然休眠期CAT活性動(dòng)態(tài)曙光油桃芽休眠期過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的變化動(dòng)態(tài)(圖1a)。結(jié)果表明：自然休眠過(guò)程中花芽和葉芽的CAT活性變化趨勢(shì)相似，此變化動(dòng)態(tài)與已測(cè)定的芽H2O2含量變化動(dòng)態(tài)相一致[20]。休眠前期芽CAT活性較低，11月1日后CAT活性迅速上升，花芽由11月1日的0.28 mg·H2O2·g-1FW·min-1增加至1.97 mg·H2O2·g-1FW·min-1，增加了3.17倍。此后，CAT一直保持較高活性，但存在下降趨勢(shì)，至12月20日始急劇下降，花芽由1.2 mg·H2O2·g-1FW·min-1降至0.52 mg·H2O2·g-1FW·min-1，下降了56%，葉芽亦下降了一半多。最后CAT活性一直保持較低水平。CAT活性迅速增加和急劇變化的時(shí)間與H2O2含量變化非常一致，而且與芽自然休眠進(jìn)程變化相吻合，說(shuō)明CAT通過(guò)調(diào)控H2O2含量變化而影響自然休眠進(jìn)程。試驗(yàn)結(jié)果還可以看出，CAT在整個(gè)休眠期活性變化中，花芽的CAT活性始終高于葉芽。

2.1.2 自然休眠期POD活性動(dòng)態(tài)曙光油桃芽休眠期POD活性變化動(dòng)態(tài)(圖1b)。結(jié)果表明：自然休眠過(guò)程中花芽和葉芽的POD活性變化趨勢(shì)相似，但變化動(dòng)態(tài)與CAT的變化動(dòng)態(tài)不同。10月20日～11月10日，POD活性較低，平均為5.16△OD·g-1FW·min-1，自11月10日始，POD活性迅速上升，花芽由11月10日的5.44△OD·g-1FW·min-1上升到11月20日的10.50△OD·g-1FW·min-1，增加了1.93倍。此后POD活性一直呈逐漸上升趨勢(shì)，到1月20日，POD活性已達(dá)18.00△OD·g-1FW·min-1，比試驗(yàn)開(kāi)始10月20日的5.05△OD·g-1FW·min-1增加了近3.56倍。休眠期芽POD活性變化動(dòng)態(tài)與測(cè)定的H2O2含量變化并不吻合，尤其是自然休眠結(jié)束時(shí)芽?jī)?nèi)H2O2含量急劇下降，而POD活性非但沒(méi)有降低，反而持續(xù)增加。這與王鵬等對(duì)馬鈴薯塊莖休眠與萌發(fā)的研究結(jié)果不一致，他們認(rèn)為POD是調(diào)控馬鈴薯塊莖休眠的關(guān)鍵酶[16]，當(dāng)POD活性下降，可能促進(jìn)了IAA含量的升高，加速休眠的解除。但與溫室杏樹(shù)POD含量變化相一致[17]，可能酶的表達(dá),有利于增加細(xì)胞的保水力，也表明POD活性升高可能是休眠解除的原因之一。進(jìn)一步證明抗氧化酶活性的改變可影響休眠的進(jìn)行。同時(shí)由圖可以看出，在整個(gè)變化過(guò)程中，花芽的POD活性始終高于葉芽。

2.1.3 自然休眠期SOD活性動(dòng)態(tài)SOD活性變化動(dòng)態(tài)（圖1c）與前面測(cè)定的CAT、POD不同，總體來(lái)看是先下降后上升的趨勢(shì)。休眠前期花芽和葉芽SOD活性較高，低溫來(lái)臨后，SOD活性下降，自11月20日至12月20日近30 d的時(shí)期內(nèi)一直維持較低的穩(wěn)定水平，其活性平均為27.07 U·g-1FW，之后于12月30日又開(kāi)始上升，并保持較為穩(wěn)定的活性水平。花芽的SOD活性高于葉芽，這一點(diǎn)與CAT、POD的屬性相同。SOD活性變化動(dòng)態(tài)與陳登文等在杏枝芽?jī)?nèi)的研究結(jié)果相一致[18]。在秋末冬初時(shí)由于外界低溫的影響，使樹(shù)體內(nèi)自由基含量增加，為防止對(duì)樹(shù)體造成傷害，此時(shí)需SOD來(lái)清除體內(nèi)的自由基，所以SOD活性開(kāi)始較高，隨著低溫的不斷累積，SOD活性升高，說(shuō)明枝芽低溫需求量的變化與植物體內(nèi)SOD活性有關(guān)。SOD作為催化超氧自由基產(chǎn)生H2O2的主要酶類(lèi)，一般認(rèn)為SOD活性上升，H2O2的生成量也應(yīng)上升，但從試驗(yàn)結(jié)果得出，其活性與之前芽?jī)?nèi)H2O2的含量變化并不一致?？赡苁强叟锖鬁囟认鄬?duì)升高，桃芽?jī)?nèi)自由基含量相對(duì)減少.而此時(shí)H2O2含量上升，說(shuō)明自然休眠過(guò)程中H2O2來(lái)源的多樣性。

圖1 ‘曙光’油桃芽休眠期抗氧化系統(tǒng)酶的活性動(dòng)態(tài)Fig.1 Dynamical changes of antioxidant enzymes activity during the dormancy of nectarine buds

2.2 不同溫度處理對(duì)CAT、POD、SOD活性的影響

2.2.1 不同溫度處理對(duì)休眠芽CAT活性的影響利用人工控制溫度的方式探討休眠季低溫、高溫對(duì)芽CAT活性的影響（圖2a）。結(jié)果表明：不同溫度處理對(duì)芽CAT活性影響不一樣，20℃高溫處理后2 d，CAT活性升高，但隨后下降，且一直低于5℃及室外自然溫度條件下的芽CAT活性，差異顯著（P=0.05），處理后10 d，20℃條件下芽CAT活性分別比5℃低38.9%、較室外自然條件低36.75%；5℃恒溫處理與室外自然溫度相比，二者在測(cè)定期內(nèi)，CAT活性呈下降趨勢(shì)，但前者的CAT活性仍高于后者，表明有利于自然休眠進(jìn)行的低溫誘導(dǎo)了芽?jī)?nèi)CAT活性的升高。

2.2.2 不同溫度處理對(duì)休眠芽POD活性的影響以室外自然條件為對(duì)照，對(duì)休眠期曙光油桃進(jìn)行低溫和高溫處理（圖2b），結(jié)果表明：雖然處理后2 d兩種溫度條件下的POD活性均有升高，但此后的變化趨勢(shì)不同。5℃低溫使POD活性持續(xù)升高，而20℃高溫剛好作用相反，使POD活性緩慢降低；二者比較，5℃處理的POD活性顯著高于20℃處理的POD活性，亦高于室外自然條件下的POD活性。處理后10 d，5℃條件下POD活性為8.44△OD·g-1FW·min-1而20℃條件下僅為4.024△OD·g-1FW·min-1，前者是后者的2.10倍。說(shuō)明低溫處理通過(guò)提高POD活性而增加了芽?jī)?nèi)H2O2的含量，這與前面低溫處理提高芽H2O2的含量的結(jié)果相符。

2.2.3 不同溫度處理對(duì)休眠芽SOD活性的影響與高、低溫度對(duì)CAT、POD活性影響效應(yīng)不同(圖2c)，休眠季人工控制的恒低溫5℃處理在一定程度上降低了SOD活性，但與自然條件下的SOD活性相比，差異不顯著；而20℃恒高溫處理卻明顯提高了芽SOD活性，處理后10 d，20℃條件下的SOD活性為36.09 U·g-1FW，而5℃和自然條件下分別為23.5420.19 U·g-1FW。與休眠期芽H2O2含量變化相聯(lián)系，不同溫度對(duì)SOD活性影響的結(jié)果說(shuō)明，SOD催化的反應(yīng)并不是產(chǎn)生H2O2的主要途徑。

圖2 休眠期不同溫度處理對(duì)‘曙光’油桃花芽抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響Fig.2 Effects of different temperatures on antioxidant enzymes activity of nectarine bud during dormancy

3 討論

對(duì)于休眠過(guò)程中的抗氧化系統(tǒng)的變化，國(guó)內(nèi)研究較少，國(guó)外有一些報(bào)道[7,19]。一般認(rèn)為通過(guò)活化的抗氧化系統(tǒng)清除氧自由基，CAT、POD、SOD等酶活性上升，抗壞血酸、還原態(tài)的谷胱甘肽等物質(zhì)含量上升，同時(shí)抗環(huán)血酶和氧化型谷胱甘肽等物質(zhì)含量下降。這些結(jié)果似乎表明抗氧化系統(tǒng)的活化是打破休眠的原因或條件。這一推理遵循的理論基礎(chǔ)是H2O2等活性氧為有毒的代謝產(chǎn)物，徹底清除促進(jìn)代謝的正常進(jìn)行，而沒(méi)有考慮H2O2等活性氧是否具有其它生理功能。

植物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2一般由CAT分解或被POD利用，這與休眠期花芽?jī)?nèi)CAT的活性變化所報(bào)道基本一致。既有低溫處理期CAT表現(xiàn)出較高活性，在打破休眠時(shí)活性下降，又有高溫處理CAT活性基本保持在一個(gè)略低于低溫處理水平上的較穩(wěn)定的或者說(shuō)有波動(dòng)的CAT活性[6]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨低溫需求量的累積，CAT活性升高，自然休眠結(jié)束時(shí)CAT活性迅速下降，變化趨勢(shì)與H2O2含量一致，與上述結(jié)果相符。人工控制的恒低溫處理提高了CAT活性，而高溫處理則使CAT活性降低，這也與溫度對(duì)H2O2含量的影響相一致。

此外，在休眠期NH4NO3、KNO3、尿素等打破休眠有效的化學(xué)脫葉處理促進(jìn)了CAT活性的下降，起到了促進(jìn)H2O2積累的作用。Nir等[1]報(bào)道，Cyanamide(氫氰胺)較好地促進(jìn)打破休眠的同時(shí)也誘導(dǎo)CAT活性下降。有人認(rèn)為CAT活性的降低是打破休眠的原因，然而高溫條件下CAT活性一直低于低溫處理的CAT活性，但是高溫處理并不能打破休眠。因此，CAT活性的降低可能是打破休眠后的結(jié)果而不是原因。聯(lián)系同期花芽?jī)?nèi)H2O2含量，在打破休眠后CAT活性下降時(shí)H2O2含量也處于低水平狀態(tài)。花芽?jī)?nèi)CAT活性的變化也可能是受H2O2含量下降而引起的。

除CAT外，POD也具有清除H2O2的功能，同時(shí)POD也受底物H2O2的誘導(dǎo)。POD作為生物體內(nèi)的一種重要酶，存在一系列同工酶，在不同時(shí)期不同器官起著重要的生理功能。關(guān)于POD在打破休眠中的作用，鄭光華[20]等認(rèn)為POD可能促進(jìn)種子的PPP途徑而促進(jìn)休眠的解除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，整個(gè)休眠期POD活性一直升高，自然休眠結(jié)束時(shí)POD活性并沒(méi)有降低；低溫和化學(xué)脫葉處理均不同程度地使POD活性增強(qiáng)。目前還不清楚在休眠的桃花芽中POD對(duì)H2O2的清除作用占據(jù)什么地位，但實(shí)驗(yàn)表明低溫促進(jìn)POD活性升高可能是休眠解除的原因之一。

H2O2的產(chǎn)生與SOD活性直接相關(guān)。SOD是抗氧化系統(tǒng)中的一種重要酶，普遍存在植物體內(nèi)，催化超氧陰離子自由基歧化分解：O2+O2+2H—H2O2+O2

反應(yīng)產(chǎn)物為H2O2和O2。因此，高的SOD活性促進(jìn)H2O2的產(chǎn)生。然而，試驗(yàn)結(jié)果表明，整個(gè)休眠期SOD活性一直較低，且對(duì)打破休眠有良好效果的低溫處理顯著抑制了SOD活性，對(duì)打破休眠無(wú)效或有逆轉(zhuǎn)作用的高溫處理卻大大促進(jìn)了SOD活性的提高。此外化學(xué)脫葉處理也提高了SOD活性，而此時(shí)花芽?jī)?nèi)H2O2的含量卻增高。以上結(jié)果說(shuō)明SOD并不是休眠過(guò)程催化產(chǎn)生H2O2的主要途徑，但對(duì)自然休眠會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響。有關(guān)抗氧化系統(tǒng)在自然休眠中的變化、作用以及如何調(diào)控自然休眠的的機(jī)理機(jī)制還需更進(jìn)一步的研究。

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Changes in the Activity of Antioxidant Enzymes(CAT,POD,SOD) during the Dormancy of Nectarine Buds

ZHU Cui-ying,FU Xi-ling,SUN Ming-yue,CHEN Xiu-de,XIAO Wei,LI Ling
College of Horticulture Science and Engineering/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,China

To investigate the dynamic changes of antioxidant enzymes including CAT,POD,and SOD that present in buds during dormancy and analyze the effects of three antioxidant enzymes treated by low temperature(5℃),higher temperature (20℃)with the nectarinePrunus persicavar.nectarinacv.Shuguang as the test material.The results indicated that CAT activity was very low in earlier stage of dormancy and then rose quickly,it dropped sharply after the end of dormancy.POD activity of dormant bud was also low in earlier stage and then kept rising,it didn’t drop during the whole experimental period. SOD activity was high at earlier stage,then dropped to a low activity when the outdoor lower temperature came and maintained a very low level,it only rose slightly after the end of dormancy.The controlled constant low temperature at 5℃made CAT and POD activity rise,but that of SOD activity dropped.Constant high temperature at 20℃dropped the CAT and POD activity but raised that of SOD activity.

Peach;dormancy;CAT;POD;SOD

S662.1;TQ073+.1

:A

:1000-2324(2015)06-0808-04

2014-08-20

:2014-09-08

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系水果產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)—栽培與設(shè)施裝備(SDAIT-03-022-05);山東省良種工程-設(shè)施專(zhuān)用水果新品種選育

朱翠英(1962-),女,講師,主要從事園藝栽培與品種選育研究.E-mail:chunying196217@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:lilingsdau@163.com