H22昆明鼠肝癌原位模型的建立①

侯 杰，羅 蘭，焦成斌，楊彥民，何其勇，張曉麗，劉偉新

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外二科，黑龍江 佳木斯 154003)

H22昆明鼠肝癌原位模型的建立①

侯 杰，羅 蘭，焦成斌，楊彥民，何其勇，張曉麗，劉偉新

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外二科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:建立H22昆明鼠肝癌原位模型,探討其基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用價(jià)值,為肝細(xì)胞癌的實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。方法:嚴(yán)格無菌及無瘤技術(shù)條件下開腹為100只雄性昆明鼠采用肝癌H22細(xì)胞株肝臟接種，建立小鼠肝癌原位模型。結(jié)果:100只昆明鼠中有95只造模成功，22只小鼠出現(xiàn)肝癌右葉轉(zhuǎn)移。結(jié)論:H22昆明鼠肝癌原位模型成功率高，成本低，值得推廣,是非常理想的研究肝癌的實(shí)驗(yàn)動物模型。

H22；肝癌；原位模型；動物實(shí)驗(yàn)

原發(fā)性肝癌(HCC)是嚴(yán)重危害人類生命健康的重大疾病，其惡性程度高,預(yù)后極差，素有“癌中之王”的稱號。在我國惡性腫瘤中的死亡率僅次于胃癌，居于第二位，且發(fā)病率仍在逐年上升，某些省市統(tǒng)計(jì)胃癌發(fā)病率，死亡率已經(jīng)躍居第一位。目前，世界上各國都積極致力于肝癌的基礎(chǔ)和臨床研究，為肝癌的治療提供了可靠的基礎(chǔ)依據(jù)，其中，肝癌的動物模型是原發(fā)性肝癌臨床與基礎(chǔ)研究工作的最重要工具，肝癌動物模型是進(jìn)行肝癌實(shí)驗(yàn)研究的重要平臺和手段[1]。因此,無論是從基礎(chǔ)和臨床研究的角度及對肝癌進(jìn)行治療的領(lǐng)域，我們都有必要建立一個理想的類似人肝癌的動物模型,這一點(diǎn)對于研究及探討原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及藥物治療均有著極其重要的意義，在各種動物模型中，小鼠肝癌原位移植模型能更好地模擬人類肝癌在體內(nèi)的生長環(huán)境，更能客觀真實(shí)的反映人類肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的過程，具有極高的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用價(jià)值，尤其值得提出的是在本實(shí)驗(yàn)造模過程中，筆者充分發(fā)揮了腫瘤外科的優(yōu)勢，采用無瘤操作原則，有效的避免腫瘤細(xì)胞逃逸及種植，與以往的各種造模方法比較，有效的避免了腫瘤細(xì)胞脫落，逃逸，腹腔種植導(dǎo)致的腹水形成，筆者的造模方法失敗率低，模型成功率高，值得推廣。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

①實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，體重18～22g，雄性，各小鼠間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。②腹水型肝癌H22細(xì)胞株，1640培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液，PBS溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

H22肝癌細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)室動物房內(nèi)昆明鼠腹腔內(nèi)傳代保存。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時無菌操作,抽取腹腔接種H22肝癌細(xì)胞株的小鼠腹水，在腹腔液中加入PBS液,低速離心，顯微鏡下計(jì)數(shù)H22細(xì)胞數(shù),用生理鹽水調(diào)整單細(xì)胞液濃度為2×107/mL備用。接種數(shù)量為H22小鼠肝癌單細(xì)胞懸液0.05mL(1×106個細(xì)胞)于小鼠左肝膈面。

手術(shù)步驟取小昆明鼠，抓取固定，腹部剃毛，75%醫(yī)用酒精消毒，按小鼠體重的0.3%比例行水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉起效后，將小鼠四肢固定于小手術(shù)臺上，腹部75%醫(yī)用酒精再次消毒，取劍突下上腹正中切口，長約1.0cm，剪開皮膚，腹白線，腹膜，壓迫止血，輕輕擠壓小鼠雙側(cè)腹壁，將小鼠肝左葉擠壓出腹腔，將1×106個H22腫瘤細(xì)胞注入左肝膈面實(shí)質(zhì)內(nèi)，退出針頭，輕壓針眼，取灼紅的鐵絲輕灼針眼，封閉針道，以防止腫瘤細(xì)胞逃逸，發(fā)生腹腔種植，將肝左葉輕輕送回腹腔，查無活動性出血，取1號絲線分別縫合腹白線及皮膚，再次消毒，術(shù)畢。

2 結(jié)果

術(shù)后一周將100只小鼠麻醉后剖腹檢查，其中，95只小鼠左肝葉可見腫塊，病灶突出肝臟表面，灰白色，質(zhì)硬，造模成功,成瘤率為95%。病理學(xué)觀察可見核異型性明顯的H22腫瘤細(xì)胞成巢團(tuán)狀、塊狀或彌漫散在分布于肝臟組織，其中，22只小鼠出現(xiàn)右肝葉轉(zhuǎn)移。

3 討論

H22肝癌細(xì)胞屬于腹水型肝癌細(xì)胞，國內(nèi)外各實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)在既往的造模過程中，往往因無法很好的解決H22腹腔種植，腹水形成的問題從而導(dǎo)致造模失敗，采用筆者的方法，簡便易行，費(fèi)用低，可很好的解決因腫瘤細(xì)胞逃逸，腹腔種植導(dǎo)致腹水形成的問題，模型成功率高，效果確切可靠，值得大力推廣。

在基礎(chǔ)和臨床的腫瘤研究中，實(shí)驗(yàn)動物模型是人類腫瘤的復(fù)制，一定程度上客觀反映人類腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的過程。動物模型在腫瘤發(fā)生機(jī)制，病理基礎(chǔ)研究及治療藥物篩選等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。肝癌動物模型是進(jìn)行肝癌實(shí)驗(yàn)研究的最重要平臺和方法。從19世紀(jì)以來各國均有許多實(shí)驗(yàn)室致力于小鼠肝癌模型的研究，期望通過對動物肝癌模型的研究，從根本上治愈這一疾病，直到20世紀(jì)初，人們經(jīng)過不懈的努力，終于獲得小鼠自發(fā)性肝癌模型，世界各國研究人員通過對肝癌動物模型不懈研究，終于,逐步建立了動物的自發(fā)性、誘發(fā)性、移植性、人類肝癌的異種移植模型以及轉(zhuǎn)基因動物肝癌模型[2～4]。當(dāng)然，各種的動物肝癌模型都各自有其優(yōu)缺點(diǎn)，其中，自發(fā)性腫瘤動物模型存在誘導(dǎo)時間長、誘導(dǎo)因素干擾多，肝癌病灶的發(fā)生時間、病變數(shù)目、大小、部位等個體差異較大。誘發(fā)性腫瘤動物模型存在肝癌發(fā)病率低，實(shí)驗(yàn)動物浪費(fèi)率高，模型穩(wěn)定性差，其病變的發(fā)生時間點(diǎn)較難預(yù)測的缺點(diǎn)，因此，該模型具有較大的研究局限性。而近年來，伴隨著分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，成功的建立了轉(zhuǎn)基因動物肝癌模型，該模型的建立使得肝癌的治療研究手段極大豐富，客觀上推動了肝癌發(fā)病機(jī)制的分子基礎(chǔ)的研究，但于此同時，因制作某些動物模型的復(fù)雜性及實(shí)際花費(fèi)的高昂費(fèi)用，在很大程度上限制了該種模型在我國的推廣和普及。。移植型腫瘤動物模型是指將來源于人動物或的癌細(xì)胞株或癌組織塊通過手術(shù)或注射接種于實(shí)驗(yàn)動物體表、體內(nèi)或機(jī)體其它部位所形成的腫瘤模型，其中以裸鼠最常應(yīng)用。1969年Rygaard通過實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了人肝癌裸鼠移植模型是除人體外最接近于人肝癌的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，該種模型的最大特點(diǎn)是造模周期短、成功率高，該模型根據(jù)癌細(xì)胞或癌組織移植的不同部位可分為：皮下、肝臟(原位移植)以及腹腔內(nèi)種植。在移植瘤模型中，既往最常采用異位皮下移植，該方法雖然成瘤率高，但因受血供及細(xì)胞因子等微環(huán)境的限制，不能反映腫瘤在人體中的特征[5]。與皮下移植瘤相比，原位移植具有血液供應(yīng)豐富及局部微環(huán)境更接近人體等優(yōu)越性，不僅移植成功率高，而且更利于形成轉(zhuǎn)移[6]，因此，國內(nèi)大多數(shù)研究機(jī)構(gòu)及實(shí)驗(yàn)室都是以移植性動物模型為主要研究工具，原位腫瘤移植模型它具有原腫瘤的組織結(jié)構(gòu)，有高度的臨床相關(guān)性，同時還保持了絕大多數(shù)的生物學(xué)特性，其中還包括轉(zhuǎn)移特性，在這一新型模型的啟發(fā)下，人們相繼建立了多種腫瘤的裸鼠移植模型，但由于裸鼠費(fèi)用較高，造模操作過程中死亡率較高，在國內(nèi)一些基層實(shí)驗(yàn)室中很難常規(guī)開展，而昆明鼠作為原位移植模型的研究可有效解決這一難題，昆明鼠作為一種易飼養(yǎng)，易存活，更經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)動物，在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)揮著重大的作用，可以普遍開展，更好，更高效的推動肝癌疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。

臨床上，腫瘤是機(jī)體中正常細(xì)胞在不同的始動與促進(jìn)因素的長期作用下，所產(chǎn)生的增生與異常分化所形成的新生物，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個連續(xù)的，多因素相互作用所造成的不良后果，在實(shí)際工作中，以人體本身作為實(shí)驗(yàn)對象深入研究和探討腫瘤的發(fā)生機(jī)制是緩慢而又難以控制的，有些疾病還與倫理學(xué)相悖，開展起來非常困難，以此積累的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)是有限的，不真實(shí)的、不可靠的，而借助于動物模型的研究，可以很好的解決這一難題，我們可以準(zhǔn)確的觀察模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與人類疾病進(jìn)行比較對照、分析，有助于快捷、有效、方便的認(rèn)識人類疾病。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用肝癌H22細(xì)胞直接種植于昆明鼠的肝內(nèi)，具有高度的臨床相關(guān)性，使其更好地模擬肝癌在人體內(nèi)的生物學(xué)特性，具有極大的應(yīng)用價(jià)值，且其造模成功率高，易于制作，有望成為未來人類研究肝癌的重要動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

[1]陳謙，孫慧，李強(qiáng), 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)肝癌動物模型的研究進(jìn)展[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2006,23(3):377-378

[2]Thorgeirsson SS，F(xiàn)acotr VM,Snyderwine EG. Transgenic mouse models in carcinogen sis research and testing[J]. Toxi Col Lett,2000,112(113):553-555

[3]Li Y，Tian B，Yang J，et al. Stepwise metastatic human hepatocellular carcinoma cell model system with multiple meta-static potentials established through consecutive in vivo selec tion and studies on metastatic characteristics[J]. J Cancer Res C lin Oncol，2004,130(8):460-468

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[6]Otte A, Gabriel G. 2009 pandemic H1N1 influenza A virus strains display differential pathogenicity in C57BL/6J but not BALB/c mice[J]. Virulence, 2011,19(6): 563-566

2013黑龍江省自然基金課題，編號：41429004-4-13036； 2013佳木斯大學(xué)青年基金項(xiàng)目，編號：Sq2013-023。

侯杰(1978～)男，黑龍江佳木斯人，在讀博士研究生。

劉偉新(1960～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:liuweixin@163.com。

R735.7

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1008-0104(2015)01-0078-02

2014-09-09)