口腔醫(yī)學(xué)中組織工程骨修復(fù)骨量不足的研究進(jìn)展

朱彪 趙剛 郭希民 郭紅延

口腔醫(yī)學(xué)中組織工程骨修復(fù)骨量不足的研究進(jìn)展

朱彪 趙剛 郭希民 郭紅延

在口腔醫(yī)療實(shí)踐過程中，常遇到骨量不足的問題。目前，臨床應(yīng)用的植骨材料包括自體骨、異體骨、異種骨和生物醫(yī)學(xué)材料等，每種植骨材料均有其特定的優(yōu)勢(shì)但又存在著各自的不足。近年來，隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，使組織工程骨替代傳統(tǒng)植骨材料用于修復(fù)口腔頜面部的骨量不足成為可能。本文就目前在此方面的科研和臨床研究進(jìn)展作一綜述。

組織工程；骨移植；口腔醫(yī)學(xué)

在進(jìn)行修復(fù)頜骨、腭骨的骨缺損，填補(bǔ)種植體周圍骨間隙，提升過低的上頜竇底等手術(shù)時(shí)，經(jīng)常會(huì)遇到術(shù)區(qū)骨量不足的情況。它增加了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，降低了手術(shù)成功率。為解決此類問題，許多人嘗試著將移植技術(shù)應(yīng)用到口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且取得了一些進(jìn)展。在眾多的移植材料中，組織工程骨有可能是最有前途的發(fā)展趨勢(shì)[1]。

組織工程學(xué)是應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的基本原理，以生物體結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系為指導(dǎo)，來構(gòu)建能修復(fù)、維持或者改善病損組織或器官功能生物替代物的一門新興交叉學(xué)科。傳統(tǒng)意義上的組織工程骨，包括種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和支架材料三部分。其移植策略是將機(jī)體細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增獲得種子細(xì)胞，并與生物活性因子和載體材料復(fù)合，再植入到體內(nèi)的缺損部位。種子細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的參與下生長(zhǎng)形成再生組織。與此同時(shí)，支架材料同步降解吸收?？谇会t(yī)學(xué)中骨組織工程研究是人體組織工程學(xué)研究的一個(gè)重要組成部分。

1 種子細(xì)胞

組織工程骨的基礎(chǔ)-種子細(xì)胞是一種干細(xì)胞，這種干細(xì)胞具有增殖和分化為不同種系細(xì)胞的潛能。按照分化階段的不同，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞（embryonic cell，ESC）和成體干細(xì)胞（adult stem cell，ASC）兩大類。ESC又稱全能干細(xì)胞，幾乎可以分化為機(jī)體所有類型的細(xì)胞。理論上講它可以為組織工程骨提供充足的細(xì)胞來源，但是凡事有利必有弊，正是因?yàn)槠渚哂腥苄裕绾问蛊浞€(wěn)定地向成骨細(xì)胞方向分化，而又不發(fā)生變異是一個(gè)問題。另外在體外培養(yǎng)時(shí)獲得純化的ESC是有難度的。因其涉及倫理道德問題，使其臨床應(yīng)用也極大地受限了。

由于ESC具有這些缺點(diǎn)，限制了其在科研和臨床中的應(yīng)用。ASC便歷史性地成為了骨組織工程研究的主力軍。ASC主要有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）、脂肪基質(zhì)干細(xì)胞（adpose derived stromal cell，ADSC）、臍血干細(xì)胞[2]、系列的產(chǎn)前干細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞等。其中BMSC因具有取材方便、容易分離、體外倍增時(shí)間短、安全穩(wěn)定、無倫理爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。而且有一項(xiàng)骨組織工程中不同干細(xì)胞成骨能力的研究表明：人BMSC比ADSC和臍帶干細(xì)胞的堿性磷酸酶染色陽(yáng)性率更高[3]。它在不同條件下可以向骨、脂肪、軟骨、骨骼肌、真皮、神經(jīng)等組織方向分化[4]。并且在一定范圍內(nèi)，ASC的接種密度和新骨形成量之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系。Pieri等[5]研究不同劑量的兔脂肪干細(xì)胞復(fù)合無機(jī)牛骨支架材料對(duì)兔顱骨骨缺損區(qū)骨量形成和該區(qū)種植體骨整合的影響，結(jié)果顯示：脂肪干細(xì)胞的接種密度和新骨形成量之間存在數(shù)量反應(yīng)關(guān)系?？傮w來看，隨著脂肪干細(xì)胞密度的增加，種植體周圍新骨形成量也增多。在研究兔后外側(cè)脊柱結(jié)合率的實(shí)驗(yàn)中，也觀察到了類似的數(shù)量反應(yīng)關(guān)系[6]。在此項(xiàng)研究中，高量BMSC（1×108）與多孔羥基磷灰石材料復(fù)合組比低量BMSC（1×106）組的結(jié)合率更高，新骨形成量也更多。

然而在實(shí)際的臨床應(yīng)用中，說服患者為了完成種植牙而抽取自身的骨髓或者脂肪等干細(xì)胞含量豐富的組織是有難度的。而誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell,iPS）有望應(yīng)用于組織工程骨的構(gòu)建。iPS和ESC在很多方面都相似，但是這兩種類型的細(xì)胞又有著本質(zhì)上的不同[7]。Miura等[8]研究證實(shí)，小鼠的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞比小鼠的胚胎干細(xì)胞具有更低的畸胎瘤形成率。

2 生長(zhǎng)因子

種子細(xì)胞的生存狀態(tài)、骨基質(zhì)的分泌、分裂和分化等都受到生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)。盡管目前對(duì)這些調(diào)節(jié)的確切機(jī)制還不是很清楚，但是生長(zhǎng)因子的確是細(xì)胞調(diào)節(jié)重要的物質(zhì)基礎(chǔ)?，F(xiàn)已明確在骨形成過程中發(fā)揮重要作用的生長(zhǎng)因子主要有骨形成蛋白（bone morphogenic proteins，BMPs）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)、類胰島素生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)等。

機(jī)體正常骨缺損愈合是通過多種生長(zhǎng)因子協(xié)同發(fā)揮作用來實(shí)現(xiàn)的，單一生長(zhǎng)因子的作用有限。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）因含有多種能促進(jìn)骨組織愈合的生長(zhǎng)因子，而被研究者所重視。而且PRP中這些生長(zhǎng)因子的濃度比較高，各種生長(zhǎng)因子的比例也與機(jī)體相似，可以通過生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用。Kanno等[9]研究PRP對(duì)人成骨樣細(xì)胞增殖與分化的影響，在80 d的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞外基質(zhì)合成量均明顯高于對(duì)照組。

但是自PRP應(yīng)用以來，對(duì)其安全性和穩(wěn)定性的爭(zhēng)議就一直不斷。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）開始進(jìn)入研究者的視線。PRF所含生長(zhǎng)因子與PRP相似，但是在其制備過程中不需要加入異種血液制品，并且PRF具有纖維蛋白立體結(jié)構(gòu)，可以使生長(zhǎng)因子相對(duì)穩(wěn)定地保存于其中。Toffler等[10]單獨(dú)將PRF作為移植材料應(yīng)用于上頜竇底提升術(shù)中。選擇了患者

110例，術(shù)前平均竇底高度為6.6mm(4.0～8.0mm)。術(shù)中僅加入PRF，然后共植入種植體138枚，種植位點(diǎn)骨高度平均增加了3.4 mm(2.5～5.0 mm)。術(shù)后11個(gè)月，僅3枚種植體脫落，初期保存率為97.8%。

同樣為了使生長(zhǎng)因子穩(wěn)定地保存于組織工程骨中發(fā)揮作用，基因工程技術(shù)也被應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域了。葉展超等[11]用攜帶BMP-2基因的腺病毒轉(zhuǎn)染犬骨MSCs，再與Bio-Oss支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程骨用于犬上頜竇底提升的手術(shù)。與沒有基因強(qiáng)化犬MSCs相比：實(shí)驗(yàn)組的新生骨量(24.74±6.33)mm2明顯多于對(duì)照組的(19.67±5.73)mm2。

3 支架材料

骨組織工程的支架材料提供了種子細(xì)胞黏附、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換、生長(zhǎng)、分裂和分化等的外部微環(huán)境，是組織工程骨的基本框架。因?yàn)闄C(jī)體的骨組織經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化選擇，其結(jié)構(gòu)與功能是相對(duì)完善的。所以自體骨是天然的骨移植修復(fù)的支架材料。但是由于其具有來源有限，需要開辟第二術(shù)野以及對(duì)第二術(shù)區(qū)的繼發(fā)影響等缺點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。支架材料經(jīng)歷了單一支架材料、復(fù)合支架材料、分層支架材料，目前的發(fā)展趨勢(shì)是三維網(wǎng)絡(luò)支架材料。從不可降解材料到可降解材料，從生物惰性材料到生物活性材料，支架材料已經(jīng)越來越接近理想的骨修復(fù)支架材料了。各種支架材料各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際的科研或臨床應(yīng)用中可以根據(jù)這些材料的特點(diǎn)選擇應(yīng)用。

目前，科研或臨床常用的單一支架材料主要有生物衍生材料（PRP、PRF、異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、珊瑚、去細(xì)胞的異體骨或者異種骨等）和生物替代材料（β-磷酸三鈣、羥基磷灰石、殼聚糖、膠原、聚乳酸羥基乙酸、生物玻璃等）兩大類。許多通過自然聚合或者生物降解與合成的多孔支架材料已經(jīng)應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域了。如周慶梅等[12]采用離子凝膠制備納米微球，微球形態(tài)良好，分散度好，無粘連，粒徑分布以380～650 nm居多。以其作為骨組織工程的支架材料，利于細(xì)胞的黏附、伸展、增殖和分化等。

單一材料可能具有無骨誘導(dǎo)性、親水性差、機(jī)械強(qiáng)度不足等不符合支架材料特性要求的缺點(diǎn)，而由不同比例構(gòu)成的復(fù)合材料可以集中兩種或者兩種以上材料的優(yōu)點(diǎn)，又在一定程度上彌補(bǔ)它們的不足。Takagi等[13]研究用殼聚糖和磷酸三鈣制備支架材料復(fù)合體，其理化性質(zhì)與人體骨組織較為接近。

支架材料的設(shè)計(jì)追求的是模擬天然組織的結(jié)構(gòu)與功能，而支架材料的分層設(shè)計(jì)有可能促進(jìn)組織的再生。因此立體控制多種異型細(xì)胞相互作用的分層支架材料可以支持整體多組織共同體的形成[14]。

比分層支架材料更靠近歷史前沿的是個(gè)體化設(shè)計(jì)的三維網(wǎng)絡(luò)支架材料。從形式上看，它與患者骨缺損部位的大小和形狀相一致；從內(nèi)容上看，其內(nèi)部復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠支持組織工程骨植入前的預(yù)先血管化。

目前應(yīng)用組織工程骨修復(fù)小面積骨缺損的二維支架材料不需要實(shí)現(xiàn)支架材料移植前的預(yù)先血管化。其內(nèi)部的種子細(xì)胞可以通過周圍毛細(xì)血管的彌散作用而獲得生存所必需的養(yǎng)分和氧氣等，新生血管床也可以從組織工程骨移植物的邊緣區(qū)域長(zhǎng)入[15]。然而目前用二維支架材料的組織工程骨修復(fù)大段骨缺損仍然是十分困難的。究其原因，在很大程度上是因?yàn)槎S支架材料不能保證大段支架材料中心區(qū)域種子細(xì)胞所必須的營(yíng)養(yǎng)成分和氧氣持續(xù)供給，溫度和pH值的恒定等。而預(yù)先血管化的三維支架材料組織工程骨有可能解決這一難題。

這樣矛盾的焦點(diǎn)就轉(zhuǎn)移到如何才能實(shí)現(xiàn)三維支架材料的預(yù)先血管化上了，而利用機(jī)體自身已經(jīng)形成的血管網(wǎng)絡(luò)是一種可能的途徑。例如：把支架材料復(fù)合到血管網(wǎng)絡(luò)上，再利用顯微血管外科的技術(shù)手段將此組織工程骨移植到骨缺損區(qū)。

以內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞的共培養(yǎng)來形成血管網(wǎng)絡(luò)是另一種可能的途徑。這就需要支架材料能夠被復(fù)制成同樣復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。如果再考慮上細(xì)胞與細(xì)胞之間，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間復(fù)雜的相互關(guān)系，那么設(shè)計(jì)這種支架材料將會(huì)更加困難。歸納一下目前文獻(xiàn)已報(bào)道的復(fù)制這種三維支架材料的方法主要有：（1）生物體組織的去細(xì)胞化[16]；（2）激光介導(dǎo)細(xì)胞植入血管樣的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[17]；（3）設(shè)計(jì)內(nèi)含微隧道結(jié)構(gòu)的支架材料[18]。

4 展望與不足

盡管在動(dòng)物模型中用組織工程骨修復(fù)頜骨骨量不足是可行的，但是能否用組織工程骨修復(fù)人頜骨骨量不足仍需用大量的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)[19]。如果能用組織工程骨修復(fù)人頜骨骨量不足，同樣需要用大量實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證的是組織工程骨在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸及其遠(yuǎn)期療效如何。在組織工程骨真正應(yīng)用于臨床之前，我們還需要進(jìn)一步理解骨組織的生長(zhǎng)發(fā)育過程，骨組織結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，骨組織受創(chuàng)傷后缺損的自然愈合的確切機(jī)制，甚至生物力作用對(duì)骨組織修復(fù)的影響等。

種子細(xì)胞是骨組織工程的基礎(chǔ)，但是我們需要進(jìn)一步證實(shí)是否是種子細(xì)胞在形成骨基質(zhì)時(shí)起作用或者說它的作用有多大。因?yàn)楣侨睋p的邊緣區(qū)同樣會(huì)有機(jī)體自身干細(xì)胞存在，它是否起作用。如果也起作用，在多大程度上起作用。

既然種子細(xì)胞的密度和新骨形成量之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系，那么是否意味著我們繼續(xù)加大接種種子細(xì)胞的密度，骨量形成會(huì)更多；還是存在一個(gè)接種細(xì)胞密度的最優(yōu)峰值，如果我們接種比峰值更大細(xì)胞密度，骨量形成反而減少。這些疑問尚且需要接種更廣范圍的細(xì)胞密度來進(jìn)一步解決。

生長(zhǎng)因子的應(yīng)用是一把雙刃劍，我們?cè)趹?yīng)用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)成骨時(shí)也不能忽略其不可避免的副作用。例如：BMP的應(yīng)用可能會(huì)帶來一系列的并發(fā)癥，包括致癌性[20]。那么是否存在一個(gè)最適濃度，應(yīng)用這一濃度的生長(zhǎng)因子既能保證有效誘導(dǎo)成骨，又能盡量把其副作用降到最小。對(duì)于不同的生長(zhǎng)因子、欲應(yīng)用的不同物種而言，這個(gè)最適濃度是否會(huì)有差異，每種情況的最適濃度又是多少。能否將生長(zhǎng)因子的緩釋系統(tǒng)或者控釋與支架材料有機(jī)結(jié)合，使生長(zhǎng)因子始終以最適濃度作用于種子細(xì)胞。

口腔顱頜面部諸骨具有較為復(fù)雜的解剖生理結(jié)構(gòu)，這無疑增加了支架材料的設(shè)計(jì)制作難度。而目前的支架材料尚不能滿足骨組織工程支架材料的要求，因此我們期待著更接近于自體骨支架材料的問世。

骨組織的生理結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)代謝與功能等相比機(jī)體其它組織要簡(jiǎn)單得多，因此組織工程骨很有可能是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的組織工程產(chǎn)品。但在這之前，我們?nèi)杂性S多工作要做。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2015.4.004

北京 100039 武警總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心 （朱彪 趙剛 郭希民郭紅延）

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