菰黑粉菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Rbf1的克隆及表達(dá)分析

胡鵬，張雅芬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

（中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，杭州，310018）

菰黑粉菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Rbf1的克隆及表達(dá)分析

胡鵬，張雅芬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

（中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，杭州，310018）

為研究菰黑粉菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換機制及灰茭形成機理，利用菰黑粉菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別從正常茭白中的菰黑粉菌（MT型）和灰茭中的菰黑粉菌（T型）中擴增得到Rbf1基因及開放閱讀框序列。結(jié)果表明，2種菰黑粉菌的Rbf1基因序列相同，開放閱讀框全長為1 281 bp，無內(nèi)含子，NCBI中blast及進(jìn)化分析表明，菰黑粉菌Rbf1基因與玉米黑粉菌具有較高的同源性；另外，菰黑粉菌不同生長階段的Rbf1基因的表達(dá)量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rbf1基因在菌絲生長前后表達(dá)量有顯著差異，在菌絲生長12 h后表達(dá)量明顯升高，表明Rbf1基因在菰黑粉菌的菌絲形成及生長過程中具有重要作用。

菰黑粉菌；Rbf1轉(zhuǎn)錄因子；菌絲生長

茭白（Zizanialatifolia），又稱菰、茭筍、茭白草，為禾本科菰屬多年生宿根草本植物，是原產(chǎn)于我國的一種重要水生蔬菜[1]。研究表明，茭白營養(yǎng)豐富，含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，其蛋白質(zhì)功效高于面粉、大米和大豆，具有很高的食用價值[2]。此外，茭白還具有很高的藥用價值，有研究表明，從茭白中提取出來的一種分子式為C31H54NaO3的白色晶體，能有效抑制成骨細(xì)胞的反常增殖，可用于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[3]。目前茭白廣泛種植于亞洲各地，我國的種植面積也逐年增加。目前的研究認(rèn)為，茭白的產(chǎn)生與茭白植株內(nèi)的菰黑粉菌（Ustilagoesculenta）的侵染互作存在較大的關(guān)系[4]。菰黑粉菌侵染茭白成功后，茭白開花受到抑制，刺激茭白莖部膨大，形成可食用的膨大莖，并且組織切片觀察發(fā)現(xiàn)正常茭白膨大莖部存在著大量的菰黑粉菌，此外在茭白地下莖、葉鞘和芽的維管束組織和薄壁組織也觀察到菰黑粉菌的分布[5，6]。田間種植發(fā)現(xiàn)，除可食用的正常茭白外，通常也會發(fā)現(xiàn)大量的不可食用的灰茭。灰茭的膨大莖中充滿黑色孢子，誤食可能會造成過敏反應(yīng)[7]，因此灰茭產(chǎn)生會對茭白的種植造成較大的經(jīng)濟損失。

菰黑粉菌是黑粉菌目黑粉菌科真菌，進(jìn)化分析表明，其與玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）及玉米絲黑穗菌（Sporisorium reilianum）具有較高的親緣關(guān)系，是一種典型的二型態(tài)真菌，存在菌絲型及酵母型兩種形態(tài)，其形態(tài)轉(zhuǎn)換及致病性與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有關(guān)。Heimel等[8]研究發(fā)現(xiàn)，玉米黑粉菌中轉(zhuǎn)錄因子Rbf是玉米黑粉菌的侵染過程中主要調(diào)節(jié)因子，Rbf1基因缺失后，玉米黑粉菌能夠形成菌絲，但是不能產(chǎn)生附著孢，導(dǎo)致其侵染性下降。另外，研究表明，在玉米黑粉菌由酵母型形成菌絲型后，Rbf1基因能夠調(diào)節(jié)Kpp6、Hdp1、Hdp2、Biz1等基因的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞周期，控制真菌的生長及附著孢形成等多個致病過程[9]。在侵入植物表皮后，Rbf1能夠與Clp1形成復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)信息素mfa及受體pra的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)菌絲的形成。

目前認(rèn)為在正常茭中菰黑粉菌通常以菌絲型形態(tài)存在，稱之為MT型，而灰茭中則主要以酵母型形態(tài)存在，稱為T型[10，11]。本課題組前期分別從龍茭2號正常茭和灰茭中分離得到MT型和T型菰黑粉菌。以MT型菰黑粉菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)設(shè)計基因特異引物，分別從MT型及T型黑粉菌中擴增得到Rbf1基因，并對其進(jìn)行相應(yīng)的序列分析。利用Real-time PCR技術(shù)檢測Rbf1基因在不同形態(tài)及不同培養(yǎng)時期的相對表達(dá)量，結(jié)果表明Rbf1基因的表達(dá)與菰黑粉菌形態(tài)轉(zhuǎn)換之間存在一定的關(guān)系。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步研究菰黑粉菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換機制及灰茭形成機理提供了一定理論基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 試驗材料

①菌株 分離自龍茭2號MT型菰黑粉菌，分離自龍茭2號灰茭的T型菰黑粉菌。

②主要試劑和儀器 SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工），pMD19-T Vector（TaKaRa），RNAiso plus（TaKaRa），LA Taq（TaKaRa），PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa），熒光定量試劑盒（TaKaRa）；普通PCR儀（Bio-Rad），核酸電泳儀（Bio-Rad），Gene Genius Bio Imaging System凝膠成像系統(tǒng)，StepOneTMReal-Time PCR System（ABI），光學(xué)顯微鏡（LEICAI DMI4000B）。

③培養(yǎng)基 YEPS培養(yǎng)基：蛋白胨 20 g、酵母粉10 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g，加水至1 000 mL，分裝后高壓蒸汽滅菌。

1.2 Rbf1基因的克隆

①菰黑粉菌Rbf1基因組序列的克隆 通過CTAB法對MT型菰黑粉菌及T型菰黑粉菌進(jìn)行總DNA提取，利用特異引物對菰黑粉菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，獲得其基因組相應(yīng)序列，經(jīng)克隆測序驗證。

②菰黑粉菌總RNA的提取 分別收集MT型和T型菌絲型及酵母型菰黑粉菌，在液氮中充分研磨成粉末，根據(jù)提取說明書提取菰黑粉菌總RNA。

③Rbf1基因開放閱讀框的擴增 采用Prime-ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成菰黑粉菌總RNA的cDNA第一鏈。同時根據(jù)MT型菰黑粉菌的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計引物（表1），采用普通PCR擴增菰黑粉菌中Rbf基因，經(jīng)割膠回收后，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，菌液驗證，挑取陽性克隆進(jìn)行測序驗證。分析其結(jié)構(gòu)，并比較分析其與玉米瘤黑粉菌等進(jìn)化關(guān)系。

1.3 Rbf1基因表達(dá)模式分析

①樣品采集觀察。以YEPS培養(yǎng)基活化、培養(yǎng)菰黑粉菌，待OD600為0.8～1.0時接種于YEPS固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)過程中的菌落形態(tài)變化，分別收集培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72、84h后的菌體。3次重復(fù)，菌體收集后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②熒光實時定量PCR檢測基因的相對表達(dá)量。菰黑粉菌總 RNA的提取同 1.2，利用PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用獲得的Rbf1 cDNA序列，按照qRT-PCR引物設(shè)計要求設(shè)計熒光特異性引物（表1）。以β-actin基因作為內(nèi)參基因，以不同培養(yǎng)時期的cDNA為模板進(jìn)行定量PCR擴增。熒光定量PCR采用SYBRGreenI染料法，反應(yīng)在StepOneTMReal-Time PCR System（ABI）檢測系統(tǒng)上進(jìn)行。Realtime PCR反應(yīng)液體系：qPCR反應(yīng)體系（25 μL）為：Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，PCR正向引物（10 μmol/ L）1 μL，PCR反向引物（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA1.0μL。反應(yīng)程序為95℃30s；95℃30s，60℃15s，72℃延伸30s，進(jìn)行40個循環(huán)，每個反應(yīng)設(shè)置3個重復(fù)樣品。熒光定量所得Ct值采用2-△△Ct法進(jìn)行分析[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菰黑粉菌Rbf1基因克隆及序列結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，實驗設(shè)計了針對Rbf1基因的開放閱讀框（ORF）的引物，分別提取MT型菰黑粉菌和T型菰黑粉菌RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴增得到相應(yīng)的Rbf1基因的ORF序列，對兩種菰黑粉菌的Rbf1序列進(jìn)行比較分析。測序結(jié)果表明，兩種菰黑粉菌中的Rbf1具有相同的ORF序列，其ORF共1281bp，編碼426個氨基酸，理論分子量為109.59KDa，理論等電點為4.94。利用其編碼序列，通過MegAlign軟件采用近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1A），結(jié)果表明，菰黑粉菌與玉米瘤黑粉菌及玉米絲黑穗菌具有較高的親緣關(guān)系，可能具有類似的功能。

對菰黑粉菌Rbf1基因組序列進(jìn)行PCR擴增后得到1281bp的基因組序列。通過NCBI中的Spidey程序?qū)⒃摶蚪M序列與Rbf1cDNA序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)其不含內(nèi)含子。Rbf1包含一個保守結(jié)構(gòu)域，編碼一個核酸結(jié)合位點，同時編碼一個鋅指結(jié)構(gòu)域（圖1B）。

2.2 菰黑粉菌Rbf1基因表達(dá)差異分析

實驗以YEPS分別培養(yǎng)T型菰黑粉菌及MT型菰黑粉菌，每隔12h觀察生長狀況及菌落形態(tài)，同時收集相應(yīng)的菌體，-80℃保存。顯微觀察結(jié)果表明，T型菰黑粉菌在培養(yǎng)36h后開始產(chǎn)生明顯菌絲（圖2A），48 h后菌絲大量生長（圖2B）；MT型菰黑粉菌則在培養(yǎng)60 h后產(chǎn)生菌絲（圖2C），72 h后菌絲大量生長（圖2D）。提取不同時間段的菰黑粉菌RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時定量PCR檢測在不同培養(yǎng)時間段Rbf1基因的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，T型菰黑粉菌在培養(yǎng)48 h后，Rbf1基因的表達(dá)量達(dá)到最大，而MT型菰黑粉菌則在72 h后表達(dá)量最大，2種黑粉菌均在菌絲生長12 h后達(dá)到最大表達(dá)量（圖3）。

3 討論與結(jié)論

目前的研究表明，菰黑粉菌在茭白孕茭的過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在茭白孕茭的早期階段，菰黑粉菌較少，其菌絲的大量增殖可能與茭白膨大密切相關(guān)[5]。 進(jìn)化分析表明，菰黑粉菌與玉米黑粉菌具有較高的親緣關(guān)系，因此推測菰黑粉菌對茭白的侵染機制可能與玉米黑粉菌相似，都必須由酵母型形態(tài)轉(zhuǎn)換為菌絲型形態(tài)，進(jìn)而侵入植物表皮細(xì)胞，獲取營養(yǎng)。在玉米黑粉菌的侵染過程中，菌絲的生長主要由信息素及信息素受體系統(tǒng)調(diào)節(jié)；而在菌絲生長后，Rbf1基因大量表達(dá)調(diào)控下游基因Biz1、Hap1等，進(jìn)而調(diào)節(jié)附著胞的形成及對植物表皮的穿透，完成整個侵染過程。同時，Rbf1能夠與Clp1、Cib1基因結(jié)合形成復(fù)合物，反饋調(diào)節(jié)信息素的表達(dá)，影響菌絲的形成[13]。

本試驗在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，通過PCR擴增得到T型和MT型菰黑粉菌的Rbf1基因組序列及RNA序列，并對其基本特點進(jìn)行分析，明確其基本結(jié)構(gòu)。同時實驗結(jié)果表明，Rbf1因子的表達(dá)與菰黑粉菌的菌絲生長有一定的關(guān)聯(lián)。無論是T型菰黑粉菌還是MT型菰黑粉菌，在培養(yǎng)初期菌絲形成階段，Rbf1基因一直處于低表達(dá)水平，沒有明顯的變化；菌絲形成后12 h，T型菰黑粉菌與MT型菰黑粉菌中Rbf1因子的表達(dá)量均顯著上調(diào)，隨后逐步下降。因此，與玉米黑粉菌類似，菰黑粉菌中Rbf1基因在菌絲的形成及快速生長過程中起著重要作用，可能與玉米黑粉菌類似，參與反饋調(diào)節(jié)信息素的表達(dá)。

在本實驗的基礎(chǔ)上，后續(xù)可進(jìn)一步篩選可能的與其相互作用的其他基因，同時可通過基因敲除及回補深入研究Rbf1基因在菰黑粉菌菌絲生長及對茭白的侵染作用，為闡明茭白的孕茭機制提供理論基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis of Transcription FactorRbf1fromUstilago esculenta

HU Peng,ZHANG Yafen,CUI Haifeng,YU Xiaoping,YE Zihong
(College of Life Sciences,China Jiliang University,Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection&Quarantine,Hangzhou,Zhejiang 310018,China)

For the study ofUstilago esculentamorphological transformation mechanism and formation mechanism of grey Jiaobai，theRbf1gene was cloned in twoU.esculentastrains isolated from white Jiaobai(MT-type)and grey Jiaobai(T-type),based on analysis of the genome and transcriptome sequencing data.Sequence analysis results indicated that the Rbf1gene sequence was conservative in the two strains,with the open reading frame(ORF)of 1 281 bp without intron. The NCBI blast and phylogenetic analysis showed that the Rbf1 had highest homology compared to that inU.maydis.In addition,microscope observation and real-time analysis results showed thatRbf1was up-regulated after the hyphae formed and to be the highest 12 h later,indicating the importance in hyphae formation and growth.

Ustilago esculenta;Transcription factorRbf1;Hyphae growth

S645.2；Q781；Q786

A

1001-3547（2015）22-0198-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.22.072

浙江省自然科學(xué)基金（LQ15C140003）；國家科技支撐計劃項目（2012BAD27B01）；國家自然科學(xué)基金項目（3147085）

胡鵬（1990-），男，碩士，研究方向為植物與微生物互作，E-mail：hpq990@163.com.

葉子弘，通信作者，電話：0571-86836062，E-mail：zhye@cjlu.edu.cn

2015-10-14