Fogarty球囊構(gòu)建兔頸總動(dòng)脈損傷及移植內(nèi)皮祖細(xì)胞治療的動(dòng)物模型

許榮睿，趙國峰，丁蓉蓉，李英豪，秦永林，趙登玲，金暉，鄧鋼

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 介入與血管外科，江蘇省分子影像與功能影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

·論 著·

Fogarty球囊構(gòu)建兔頸總動(dòng)脈損傷及移植內(nèi)皮祖細(xì)胞治療的動(dòng)物模型

許榮睿，趙國峰，丁蓉蓉，李英豪，秦永林，趙登玲，金暉，鄧鋼

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 介入與血管外科，江蘇省分子影像與功能影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

目的:利用Fogarty球囊建立兔頸總動(dòng)脈球囊損傷及損傷處移植內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPCs)治療的動(dòng)物模型。方法:培養(yǎng)兔外周血中EPCs并以Fe2O3磁性納米顆粒標(biāo)記。將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為細(xì)胞組(12只)和空白組(10只)，經(jīng)股動(dòng)脈入路利用Fogarty球囊損傷兩組兔右側(cè)頸總動(dòng)脈，并用Fogarty球囊阻斷血流后將標(biāo)記EPCs移植至細(xì)胞組血管損傷段，將生理鹽水注入空白組；術(shù)后7d取2只細(xì)胞組兔損傷血管行普魯士藍(lán)染色；術(shù)后3d,1、4、8周行MR掃描；術(shù)后8周取損傷血管，行HE、彈力纖維及PCNA染色。結(jié)果:術(shù)后7d普魯士藍(lán)染色示損傷內(nèi)膜可見含鐵EPCs附著，MR掃描示術(shù)后4周空白組兔損傷血管壁稍有增厚，術(shù)后8周明顯增厚，細(xì)胞組術(shù)后4周損傷血管管壁未見明顯增厚，8周后稍有增厚。病理學(xué)檢查示，術(shù)后8周細(xì)胞組與空白組內(nèi)膜/中膜比(N/M)分別為0.34±0.05和1.14±0.10(P<0.01)，PCNA陽性細(xì)胞指數(shù)為0.08±0.01和0.31±0.01(P<0.05)。結(jié)論:Fogarty球囊成功構(gòu)建兔頸總動(dòng)脈損傷狹窄模型并阻斷血流實(shí)現(xiàn)EPCs定向移植至血管損傷處，參與內(nèi)膜的修復(fù)。

Fogarty球囊； 球囊損傷； 再狹窄； 內(nèi)皮祖細(xì)胞

周圍動(dòng)脈疾病發(fā)病率逐年增高，經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)(percutaneous transluminal angioplasty， PTA)以其微創(chuàng)及并發(fā)癥低的優(yōu)勢(shì)而廣泛用于周圍血管疾病的治療，但遠(yuǎn)期通暢率不理想，術(shù)后再狹窄成為臨床急待解決的問題[1]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells， EPCs)是成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，能夠定位于受損血管部位，維持血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的完整性，抑制血栓形成，從而抑制血管損傷后再狹窄[2-3]。建立PTA術(shù)后再狹窄的動(dòng)物模型，是進(jìn)一步研究PTA術(shù)后的再狹窄機(jī)制和預(yù)防治療的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床介入治療路徑，通過股動(dòng)脈入路應(yīng)用Fogarty球囊構(gòu)建兔頸總動(dòng)脈損傷及損傷局部移植EPCs治療的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性新西蘭大白兔22只(南京金陵種兔場)，體重3.0～3.5kg，隨機(jī)分為細(xì)胞組(n=12)和空白組(n=10)。

1.2 主要試劑及設(shè)備

EGM-2培養(yǎng)基(Lonza，美國)，人纖維粘連蛋白(Chemicon，美國)，淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)科為)，3F雙腔Fogarty球囊導(dǎo)管(Edwards LIfesciences)，0.035超滑導(dǎo)絲(Terumo公司，日本)，3.0T MR(Simens公司，德國)，彈力纖維染色試劑盒(邁新生物)，PCNA染色試劑盒(邁新生物)，F(xiàn)e2O3磁性納米顆粒(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1兔外周血EPCs的分離培養(yǎng) 兔外周血EPCs分離培養(yǎng)的方法詳見文獻(xiàn)[4]。將Fe2O3納米磁顆粒加入第3代(約18d)EPCs的培養(yǎng)液中進(jìn)行標(biāo)記，使鐵終濃度為25μg·ml-1，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h后取部分細(xì)胞加入六孔板中，利用普魯士藍(lán)染色觀察體外細(xì)胞鐵標(biāo)記情況，余用于細(xì)胞移植。

1.3.2兔頸總動(dòng)脈損傷及損傷處移植EPCs治療模型的制作 兔全麻成功后固定于手術(shù)臺(tái)，分離右側(cè)股動(dòng)脈，Seldinger法成功穿刺右側(cè)股動(dòng)脈后引入Fogarty球囊并選入右側(cè)頸總動(dòng)脈，充盈球囊損傷血管(充盈球囊直徑∶正常動(dòng)脈直徑比值為1.2∶1.0，保留球囊壓力，來回拖拉3次，每次1min)，損傷后造影見損傷血管明顯擴(kuò)張，于頸總動(dòng)脈損傷段下端充盈Fogarty球囊阻斷局部血流，經(jīng)球囊導(dǎo)管注入含1×106ml-1EPCs的細(xì)胞懸液5ml，分5次注射，每次1ml，持續(xù)5min后緩慢恢復(fù)血流，間隔數(shù)分鐘，重復(fù)上述操作?？瞻捉M注入等量生理鹽水。

1.3.3MR檢查 兩組動(dòng)物術(shù)后3d，1、4、8周分別隨機(jī)選取2只行MR檢查。全麻后固定于3.0T MR檢查床，行T1WI、T2WI、PDWI等序列掃描。

1.3.4組織病理學(xué)檢查 術(shù)后8周處死動(dòng)物，取其頸動(dòng)脈標(biāo)本，固定后石蠟包埋，血管橫斷面切片，行HE染色，觀察新生內(nèi)膜增生程度，利用Image J軟件分析測(cè)量各組標(biāo)本血管切片內(nèi)膜、中膜厚度及其比值(N/M)；行PCNA染色，觀察平滑肌細(xì)胞增殖情況，每張切片用光學(xué)顯微鏡在高倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野下血管內(nèi)膜中血管平滑肌細(xì)胞總數(shù)及PCNA陽性細(xì)胞數(shù)(呈棕色顆粒狀著色)，求百分比，取平均值即為內(nèi)膜PCNA陽性細(xì)胞指數(shù)即平滑肌細(xì)胞增殖指數(shù)。行彈力纖維染色，觀察彈力纖維增生情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，使用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體外細(xì)胞鐵標(biāo)記

普魯士藍(lán)染色示Fe2O3納米磁顆粒標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)均可見藍(lán)色顆粒(圖1)，標(biāo)記率近100%。

圖1 體外標(biāo)記細(xì)胞普魯士藍(lán)染色結(jié)果 ×100

Fig 1 Prussian blue staining of EPCs labeled by Fe2O3invitro(×100)

2.2 球囊損傷及細(xì)胞移植模型制作

Fogarty球囊成功選入右側(cè)頸總動(dòng)脈，充盈球囊來回拖動(dòng)損傷兔右側(cè)頸總動(dòng)脈(圖2a)；損傷后路徑圖見右側(cè)頸總動(dòng)脈較左側(cè)明顯擴(kuò)張(圖2b)；于頸總動(dòng)脈損傷段下端充盈Fogarty球囊并阻斷局部血流，經(jīng)Fogarty球囊導(dǎo)管注入EPCs或等量生理鹽水(圖2c)。

圖2 球囊損傷及細(xì)胞移植模型制作DSA圖

Fig 2 DSA images of animal model with injury and EPCs transplantation

2.3 MR掃描及病理學(xué)檢查

頸總動(dòng)脈損傷后7d，行普魯士藍(lán)染色示移植細(xì)胞后的損傷血管段可見藍(lán)色顆粒狀含鐵EPCs附著于內(nèi)膜，未損傷的左側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)膜未見含鐵EPCs附著。見圖3。

頸總動(dòng)脈損傷后3d、1周行MR掃描，對(duì)照左側(cè)，術(shù)后3d右側(cè)頸總動(dòng)脈擴(kuò)張損傷血管段仍擴(kuò)張，且損傷血管壁增厚水腫，PDWI呈高信號(hào)改變，T1WI低信號(hào)(圖4a、b)，術(shù)后1周損傷血管修復(fù)增生，管腔擴(kuò)張已不明顯，兩側(cè)頸總動(dòng)脈直徑相仿，血管壁周圍水腫減輕(圖4c、d)。

兔頸總動(dòng)脈損傷后4、8周行MR掃描，術(shù)后4周對(duì)照左側(cè)，細(xì)胞組右側(cè)頸總動(dòng)脈損傷段管壁未見明顯增厚，管腔未見明顯狹窄(圖5a、b)?？瞻捉M右側(cè)血管壁可見稍有增厚，血管腔不光滑(圖5c、d)。術(shù)后8周對(duì)照左側(cè)，細(xì)胞組右側(cè)頸總動(dòng)脈管壁可見輕度增厚，管腔稍有狹窄(圖6a、b)，空白組血管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄(圖6c、d)。

術(shù)后8周切片HE、彈力纖維及PCNA染色示，空白組右側(cè)頸總動(dòng)脈損傷段血管內(nèi)膜明顯增厚，管壁增厚，新生內(nèi)膜內(nèi)彈力纖維大量增生(彈力纖維呈紫色)，新生內(nèi)膜內(nèi)見棕色顆粒狀平滑肌細(xì)胞增殖。細(xì)胞組內(nèi)膜及彈力纖維增生程度明顯減輕，新生內(nèi)膜中棕色顆粒狀平滑肌細(xì)胞增殖數(shù)量明顯減少。未損傷左側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)彈力板完整，中膜平滑肌細(xì)胞呈梭形排列整齊。見圖7～9。

a.未損傷的左側(cè)頸總動(dòng)脈； b.損傷后移植EPCs右側(cè)頸總動(dòng)脈

圖3 普魯士藍(lán)染色結(jié)果 ×400

a.The uninjured left common carotid artery; b.The injured right commom carotid artery

Fig 3 Prussian blue staining(×400)

a.術(shù)后3d MR PDWI序列成像； b.術(shù)后3d MR T1WI序列成像； c.術(shù)后7d MR PDWI序列成像； d.術(shù)后7d MR T1WI序列成像

圖4 頸總動(dòng)脈MR橫斷面平掃

a.MR PDWI on the 3rd day after injure; b.MR T1WI on the 3rd day after injure； c.MR PDWI on the 7th day after injure； d.MR T1WI on the 7th day after injure

Fig 4 MR axial scan of the common carotid artery

a.MR PDWI序列成像； b.MR T1WI序列成像； c.MR PDWI序列成像; d.MR T1WI序列成像

圖5 頸總動(dòng)脈MR橫斷面平掃(術(shù)后4周)

a.MR PDWI; b.MR T1WI; c.MR PDWI; d.MR T1WI

Fig 5 MR axial scan of the common carotid artery(the 4th week after injure)

a.MR PDWI序列成像； b.MR T1WI序列成像； c.MR PDWI序列成像； d.MR T1WI序列成像

圖6 頸總動(dòng)脈MR橫斷面平掃(術(shù)后8周)

a.MR PDWI; b.MR T1WI; c.MR PDWI; d.MR T1WI

Fig 6 MR axial scan of the common carotid artery(the 8th week after injure)

a.左側(cè)未損傷頸總動(dòng)脈； b.空白組損傷后的右側(cè)頸總動(dòng)脈； c.細(xì)胞組損傷后的右側(cè)頸總動(dòng)脈

圖7 術(shù)后8周目標(biāo)血管HE染色結(jié)果 ×200

a.The uninjured left common carotid artery; b.The injured right commom carotid artery of the blank group; c.The injured right commom carotid artery of the cell group

Fig 7 HE stain of target vessel(the 8th week after injured，×200)

a.左側(cè)未損傷頸總動(dòng)脈； b.空白組損傷后的右側(cè)頸總動(dòng)脈； c.細(xì)胞組右側(cè)頸總動(dòng)脈

圖8 術(shù)后8周彈力纖維染色結(jié)果 ×200

a.The uninjured left common carotid artery; b.The injured right commom carotid artery of the blank group; c.The injured right commom carotid artery of the cell group

Fig 8 Elastic tissue stain of target vessel (the 8th week after injured，×200)

a.左側(cè)未損傷頸總動(dòng)脈； b.空白組損傷后的右側(cè)頸總動(dòng)脈； c.細(xì)胞組損傷后的右側(cè)頸總動(dòng)脈

圖9 術(shù)后8周PCNA染色結(jié)果 ×200

a.The uninjured left common carotid artery; b.The injured right commom carotid artery of the blank group; c.The injured right commom carotid artery of the cell group

Fig 9 PCNA stain of target vessel(the 8th week after injured，×200)

2.4 兩組損傷血管N/M值及PCNA指數(shù)比較見表1、2。

3 討 論

PTA術(shù)后再狹窄的主要機(jī)制是球囊擴(kuò)張或支架植入治療中引起血管內(nèi)膜的機(jī)械性損傷導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管內(nèi)皮功能不全，引起血管壁血栓、炎癥、平滑肌細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)改變等一系列病理生理學(xué)改變，導(dǎo)致再狹窄形成[5]。因此，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是PTA術(shù)后再狹窄的始動(dòng)因素，PTA術(shù)后盡早促進(jìn)損傷血管段內(nèi)皮化，對(duì)于防止再狹窄的發(fā)生至關(guān)重要。自1997年EPCs被Asahasa等[6]發(fā)現(xiàn)以來，因其在血管損傷后的內(nèi)皮修復(fù)和血管形成中的重要作用而備受關(guān)注。

注：術(shù)后8周兩組間N/M值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01

注：術(shù)后8周兩組間PCNA指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

本實(shí)驗(yàn)采用新西蘭大白兔成功地經(jīng)股動(dòng)脈入路制作了頸動(dòng)脈狹窄的動(dòng)物模型。而既往采用直視下切開頸動(dòng)脈后置入球囊進(jìn)行球囊成形造模，與臨床介入治療頸動(dòng)脈狹窄的路徑不一致。在本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型的制作基本模擬了臨床介入治療途徑，利用Fogarty球囊經(jīng)股動(dòng)脈入路行頸動(dòng)脈PTA 在DSA下根據(jù)頸動(dòng)脈的管徑采取定比(1.2∶1)擴(kuò)張，通過MR掃描發(fā)現(xiàn)空白組兔右側(cè)頸總動(dòng)脈損傷血管段術(shù)后3d仍呈擴(kuò)張狀態(tài)，術(shù)后1周血管修復(fù)增生，4周后管壁稍增厚，管腔稍狹窄，8周后管腔明顯狹窄，病理學(xué)檢查顯示血管內(nèi)膜、彈力纖維及平滑肌細(xì)胞明顯增生，成功地模擬了PTA術(shù)后血管內(nèi)皮損傷后的病理過程。且本實(shí)驗(yàn)采用Fogarty球囊，損傷后可阻斷血流，將EPCs定向移植至血管損傷處，提高了EPCs的黏附率。較Cao等[7]通過大鼠尾靜脈注入EPCs及Ma等[8]通過夾閉兔頸總動(dòng)脈阻斷血流后局部注射EPCs等方法，此方法細(xì)胞的移植效率更高，操作更為簡易，微創(chuàng)，成功率更高，術(shù)后死亡率更低。術(shù)后通過MR及病理學(xué)檢查顯示，F(xiàn)ogarty球囊阻斷血流能夠有效地將EPCs移植至血管損傷處，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖修復(fù)損傷內(nèi)膜。

本研究成功應(yīng)用Fogarty球囊構(gòu)建兔頸總動(dòng)脈損傷狹窄模型并實(shí)現(xiàn)EPCs定向移植至血管損傷處，參與局部損傷內(nèi)膜的修復(fù)，為進(jìn)一步研究血管成形術(shù)后局部移植細(xì)胞或注射藥物預(yù)防再狹窄提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

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Construction of rabbit carotid artery balloon injury model with local transplantation EPCs to the injury by the Fogarty balloon

XU Rong-rui，ZHAO Guo-feng，DING Rong-rong，LI Ying-hao，QIN Yong-lin，ZHAO Deng-ling，JIN Hui，DENG Gang

(DepartmentofInterventionalandVascularSurgery，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，JiangsuKeyLaboratoryofMolecularImagingandFunctionalImaging，Nanjing210009，China)

Objective： To establish rabbit carotid artery balloon injury model with transplanting endothelial progenitor cells (EPCs) to the injury region by the Fogarty balloon. Methods: EPCs were isolated from rabbit peripheral blood and were incubated with Fe2O3-arginine. Rabbits were randomly divided into cell group(n=12) and blank group(n=10). The Fogarty balloon catheter was induced into the right common carotid artery(CCA) through the right femoral artery， and then blocking blood flow to transplant EPCs and equal amount of normal saline to the balloon injury local via Fogarty balloon in the cell and blank group respectively. Two rabbits in cell group were killed and the injured vessels for Prussian blue staining on 7rd day. MR was performed on 3rd day， 1th， 4th and 8th week after transplantation. The injured vessels for HE， elastic tissue and PCNA staining on 8th week after injury. Results: Prussian blue staining showed iron-labeled cells distributed in the injured endothelium. In blank group， MR showed the injured arterial wall slightly thickened at 4th week after injury， and more obvious with severe stenosis in the lumen at 8th week; In cell group， the injured arterial wall barely thickened at 4th week and slightly thickened at 8th week. The pathological study showed， the neointimal/media ratio(N/M) in cell group and blank group was 0.34±0.05 and 1.14±0.10， respectively(P<0.01); the PCNA positive cell index in cell group and blank group was 0.08±0.01 and 0.31±0.01， respectively(P<0.05)， on 8th week after injury. Conclusion: The Fogarty balloon can be used to establish rabbit carotid artery balloon injury model， followed by local transplantation EPCs to the injury region.

Fogarty balloons; balloon injury; restenosis; endothelial progenitor cells

2015-01-29

2015-03-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171433/H1816)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2242015K40009)

許榮睿(1990-)，女，安徽滁州人，在讀碩士研究生。E-mail：njxurongrui@163.com

鄧鋼 E-mail：dmm1996@163.com

許榮睿,趙國峰,丁蓉蓉,等.Fogarty球囊構(gòu)建兔頸總動(dòng)脈損傷及移植內(nèi)皮祖細(xì)胞治療的動(dòng)物模型[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2015,34(4)：582-587.

R-332； R654.3； R543.4

A

1671-6264(2015)04-0582-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．018