四氯化碳誘導兔肝纖維化模型的改良

侯洪偉，潘崢，2，陳敏，徐佳佳，李衛(wèi)民，嵇振嶺，2

(1.東南大學醫(yī)學院，江蘇南京 210009； 2.東南大學附屬中大醫(yī)院普外科，江蘇南京 210009；3.東南大學附屬中大醫(yī)院病理科，江蘇南京 210009)

·論 著·

四氯化碳誘導兔肝纖維化模型的改良

侯洪偉1，潘崢1，2，陳敏1，徐佳佳3，李衛(wèi)民1，嵇振嶺1，2

(1.東南大學醫(yī)學院，江蘇南京 210009； 2.東南大學附屬中大醫(yī)院普外科，江蘇南京 210009；3.東南大學附屬中大醫(yī)院病理科，江蘇南京 210009)

目的：通過改良傳統(tǒng)四氯化碳(CCl4)法誘導兔肝纖維化模型，提高以肝纖維化模型為基礎的相關研究的實驗效率及動物模型質量。方法：選取50只健康雄性新西蘭大白兔，每批25只。首批實驗(傳統(tǒng)組)將動物隨機分為兩組，造模組21只，皮下注射50% CCl4橄欖油溶液，每周兩次；對照組4只，相同方法皮下注射純橄欖油，注射12周，觀察記錄兔一般情況。造模組于0、4、8、12周行影像學及血清學生化指標檢測，每次采血后隨機處死7只兔(兔意外死亡時按剩余數(shù)量均分計)，測門靜脈壓(PVP)并取組織行HE、Masson、免疫組化染色及ISHAK評分；對照組12周后處死大白兔，其余處理同造模組。針對第1批實驗中暴露的問題進行改良，將改良方案應用于第2批(改良組)實驗。結果：傳統(tǒng)造模組及改良造模組動物死亡率分別為42.9%和9.5%，造模成功率分別為57.1%和85.7%，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。改良組兔體重、丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸轉氨酶、白蛋白、總膽紅素與對照組相比隨實驗進行出現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義的變化(P<0.05)；造模組12周時門靜脈血流速度較對照組減慢，螺旋CT掃描顯示造模組肝實質密度較對照組降低，HE、Masson及免疫組化染色可見肝實質發(fā)生明顯纖維化改變并可見假小葉形成，造模組4、8、12周時ISHAK評分分別為(1.33±0.52)、(1.83±0.75)、(4.17±0.75)分。結論：通過對CCl4誘導兔肝纖維化模型的傳統(tǒng)造模方案進行針對性改良，可在保證造模成功率的基礎上降低動物死亡率，為以動物肝纖維化模型為基礎的實驗研究打下良好基礎。

肝纖維化； 肝硬化； 兔； 動物模型； 四氯化碳

肝纖維化是肝臟針對幾乎所有病因引起的慢性損傷的修復反應，早期肝纖維化可以限制損傷因素的擴散，對肝臟起到一定的保護作用；但在持續(xù)的病理因素刺激下肝纖維化持續(xù)發(fā)展，最終將導致其終末期改變——肝硬化的發(fā)生[1]。肝臟纖維化發(fā)展呈漸進性，相關研究表明早期變化可逆轉[1-3]，但終末期肝硬化逆轉困難。因此，及時阻止纖維化的發(fā)展對于慢性肝臟疾病的治療極其重要，而肝纖維化動物模型的建立是人類肝臟疾病研究的重要前提[4]。

目前大量的肝纖維化相關研究都基于鼠類模型[5-8]，但由于鼠類體積小、血量少、生命力較差的緣故不適于長期的血清學、影像學及形態(tài)學研究，而兔可以很好地克服這些不足。本研究采用新西蘭大白兔作為模型載體，通過持續(xù)皮下注射四氯化碳(CCl4)溶液誘導兔肝纖維化模型，并對兔的一般情況、血清學、形態(tài)學及病理學等方面的特點進行觀察研究，通過改進傳統(tǒng)造模流程，在保證造模成功率的基礎上最大程度地降低動物死亡率，為以肝纖維化為前提的實驗研究提供較理想的造模方案。

1 材料與方法

1.1 試劑

CCl4(分析純)和橄欖油(南京化學試劑有限公司)取等量配成50%混合溶液，常溫密封保存?zhèn)溆谩Ｆ交〖拥鞍?α-sma)一抗(英國Abcam)，Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)一抗(北京博奧森)，HRP-山羊抗小鼠二抗及HRP-山羊抗兔二抗(美國KPL)。

1.2 動物

健康新西蘭大白兔50只，雄性，體質量2.20～2.78 kg，4月齡，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院種兔場提供，全部通過檢驗檢疫，飼養(yǎng)于東南大學醫(yī)學院動物實驗中心，提供兔專用飼料，自來水飲水，自然生長1周，1周后進行分組實驗。

1.3 肝纖維化模型建立

1.3.1傳統(tǒng)組方案 傳統(tǒng)組造模注射劑量及頻次在參照相關文獻描述[5-6,9]的基礎上，決定采取50%濃度、1 ml·kg-1、每周兩次皮下注射方式，連續(xù)注射12周。

1.3.2改良組方案 (1) 注射劑量：初始劑量降至0.5 ml·kg-1，濃度不變；(2) 由單點注射改為多點皮下注射，一次劑量同一日內分兩次注射，間隔不小于8 h；(3) 根據(jù)動物一般狀態(tài)調整注射劑量，良好者可按0.5 ml·kg-1遞增，上限3 ml·kg-1，若動物出現(xiàn)拒食、活動減少等中毒現(xiàn)象，酌情減少用量或停注1～2次；(4) 采用動物來源地相同飼料，實驗開始時間選在較為溫暖的4月。

1.4 血生化檢查

于0、4、8、12周末經(jīng)兔耳中央動脈采血。生化檢查項目包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、前白蛋白(PALB)、堿性磷酸酶(ALP)。

1.5 影像學檢查

進行相關檢查前動物禁食12 h，禁水6 h，耳緣靜脈推注1%戊巴比妥4 ml·kg-1麻醉，行常規(guī)腹部CT檢查及彩色多普勒超聲檢查。

1.6 組織染色及病理分級

造模組于4、8、12周末分別用過量麻醉法處死7只兔(兔意外死亡時按剩余數(shù)均分計算)，觀察肝臟外觀變化情況，行HE、Masson及免疫組化(α-sma及Col-Ⅰ)染色，鏡下觀察肝組織變化情況，并采用ISHAK標準[10]進行組織學評分。

1.7 門靜脈壓(PVP)測量

經(jīng)腸系膜上靜脈分支穿刺插管至門靜脈，水柱測壓計測量PVP[11]。

1.8 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，血清生化指標采用單因素方差分析進行比較，死亡率采用Fisher精確概率法比較，體重數(shù)據(jù)組內比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

因傳統(tǒng)組死亡率高無法統(tǒng)計，以下獨立數(shù)據(jù)均取自改良組。

2.1 造模方案改良前后成功率及死亡率比較

傳統(tǒng)組造模兔21只，非正常死亡9只，死亡率42.9%；改良組造模兔21只，非正常死亡2只，死亡率9.5%，12周時傳統(tǒng)組及改良組分別有12只及18只兔成功達到了早期肝硬化狀態(tài)(ISHAK≥4分)，成功率分別為57.1%和85.7%；兩組中動物主要死亡原因為拒食拒飲，4周內是死亡高峰期(圖1)。

2.2 一般情況

對照組兔機警性高，對外界聲光刺激反應迅速，活動較頻繁，食欲好，進食量較大，體重增長迅速，毛發(fā)濃密有光澤；造模組兔隨注射時間增加，對外界刺激反應逐漸遲緩，活動減少，進食水量減少，毛發(fā)蓬亂無光澤，少數(shù)毛發(fā)脫落較嚴重；藥物注射后4周內時間段動物藥物不良反應明顯，出現(xiàn)體重下降及拒食現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)急性中毒死亡。對照組兔體重隨時間呈遞增趨勢，且8、12周與0周比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);造模組兔體重未見明顯改變；0周時兩組兔體重間差異無統(tǒng)計學意義，4、8、12周時對照組兔體重明顯高于造模組(P<0.05)(圖2)。

aP<0.05

圖1 12周時傳統(tǒng)組與改良組兔死亡率及造模成功率比較

Fig 1 Comparison of mortality of rabbits and success rate of modeling between traditional patch and modified patch at 12th week

a 組內不同時間點兔體重與0周比較,P<0.05; b 同一時間點兔體重組間比較,P<0.05

圖2 改良造模組與對照組兔體重隨時間變化情況

Fig 2 Comparison of changes of weights in rabbits in modeling group of modified patch and control group

2.3 血清生化檢查結果

注射CCl44周后ALT、AST較0周明顯增高，并維持于較高狀態(tài)；ALB呈降低趨勢，12周與0周比較差異有統(tǒng)計學意義；TBil呈波動性變化，其中4周時升高明顯;其余指標各時間點未見明顯變化(表1)。

2.4 影像學檢查結果

彩色多普勒超聲(圖3a、b)示：a為對照組肝臟圖像，b為造模組12周時肝臟圖像，兩者肝實質回聲比較未見明顯變化，但造模組兔門靜脈血流速度(12.8 cm·s-1)較對照組(23.0 cm·s-1)明顯減慢；CT(圖3c、d)示：c、d分別為對照組及造模組12周時兔肝臟斷面圖像，其中d圖像肝臟斷面平均CT值54 HU，明顯低于對照組94 HU，肝臟密度降低，提示造模組在形成肝纖維化的同時可能伴有不同程度的肝脂肪變性。

2.5 PVP變化

整個試驗過程中動物PVP呈進行性升高趨勢，但變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

不同時間點數(shù)據(jù)與0周時比較：aP<0.01; bP<0.05

圖3 改良后對照組(a、b)與造模組(c、d)12周時兔彩色多普勒及CT檢查結果

Fig 3 Color Doppler flow imaging and CT scan of rabbits of control group and modeling group in modified group

2.6 組織外觀、病理學檢查及ISHAK分期

0周時：肝臟色澤紅潤，表面光滑，質地柔軟，HE及Masson染色可見肝細胞索排列整齊，無明顯炎細胞浸潤，肝小葉結構清晰，肝血竇以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝實質免疫組化未見明顯Col-Ⅰ及α-sma異常表達；12周時：造模組兔肝臟外觀呈淺棕色，表面凹凸不平，有小結節(jié)樣改變，質地硬，HE染色可見部分肝細胞空泡樣脂肪變性，正常肝小葉結構破壞伴纖維間隔形成，肝細胞索排列紊亂，伴炎癥細胞浸潤，可見部分假小葉形成；Masson染色可見匯管區(qū)膠原纖維明顯增生，形成纖維間隔，包繞、分割正常肝組織，假小葉形成；免疫組化可見匯管區(qū)及纖維間隔中Col-Ⅰ及α-sma表達明顯升高(圖4)。造模組4、8、12周時ISHAK評分分別為(1.33±0.52)、(1.83±0.75)、(4.17±0.75)分，提示隨著造模時間延長，肝纖維化程度呈遞增改變。

A、B、C、D分別代表肝臟組織HE染色、Masson染色、免疫組化標記Col-Ⅰ及α-sma鏡下表現(xiàn)； 1、2分別代表0周和12周

圖4 改良后造模組0周與12周時兔肝臟組織病理學變化比較 ×100倍光鏡

Fig 4 Histopathologic comparison between 0 and 12 weeks of modeling group in modified patch(Magnification:×100)

3 討 論

目前對于肝纖維化機制的理解很大程度上依賴于對動物模型的研究。良好的動物模型應該能夠模擬人類疾病的形態(tài)學、組織學的漸進性變化，并且具有較好的可重復性及低死亡率，能夠產(chǎn)生可逆及不可逆性的病理生理學結局[12]。將動物種屬及造模方法合理搭配形成最優(yōu)化的造模方案，是保證各項相關研究順利進行的基礎。

在肝纖維化模型制作方面，國內外相關研究主要討論的問題包括動物的選擇、造模方式及與研究內容的相關性等。George等[13]通過腹腔注射DMN法成功制作出了小鼠肝硬化模型，指出DMN法制作小鼠肝纖維化模型可為人類肝硬化的研究提供可重復及有價值的動物模型平臺，但其實驗動物14 d 25%及21 d 42%的高死亡率阻礙了后續(xù)研究的實施。Chang等[14]將肝毒性藥物法與結扎膽總管法制作鼠類肝硬化模型相比較，指出結扎膽總管法造模時間短，但同樣面臨動物死亡率高的問題，適用于短期研究；CCl4法造模的時間及動物死亡率與藥物劑量及注射方式有關，可用于急慢性肝纖維化研究。Ding等[4]通過皮下注射CCl4在16周時誘導出猴肝硬化模型，成功率75%，他指出由于生理相似性，靈長類動物更適用于人類相關疾病研究的動物模型。陳剛等[15]通過皮下注射CCl4法成功誘導大鼠肝纖維化模型，但仍有20%的較高動物死亡率。

CCl4具有選擇性的肝臟毒性，長期注射可誘導肝纖維化，其引起肝細胞損害的重要原因是CCl4導致膜脂質過氧化或與蛋白質的巰基反應[12]。大量研究[3,16-17]表明，HSC表型改變導致了纖維化過程中ECM的過度沉積；同時膠原蛋白酶合成減少[18]及基質金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)表達失調導致ECM的分解減少也是肝纖維化發(fā)展的重要原因。由于具有多種給藥途徑、可重復、組織學變化相對連續(xù)等優(yōu)點，CCl4可作為肝纖維化模型較為理想的誘導劑。

血清生化指標是檢測肝臟損傷程度的重要手段：ALT血液中濃度升高與肝細胞損傷、肝細胞膜通透性增高有關，AST反映肝細胞內線粒體損傷程度，ALB是反映肝臟整體合成功能的重要指標。在纖維化的肝組織中Col-Ⅰ由肌成纖維細胞大量分泌，主要存在于富含肌成纖維細胞的纖維隔膜的中心部分[19]，α-SMA是肝星狀細胞的活化標志，這兩種蛋白表達水平與肝纖維化程度密切相關。

本實驗結果證明，CCl4皮下注射能夠成功誘導兔肝纖維化模型，同時較其他造模方法具有簡便、經(jīng)濟、可重復且造模成功率高等優(yōu)點。血清生化指標方面，AST、ALT明顯升高，并在造模過程中維持于較高水平，提示CCl4對肝細胞具有相對特異的毒性作用，持續(xù)的肝臟損傷進一步破壞了肝臟合成功能，導致ALB合成減少，但肝臟儲備功能仍保持相對穩(wěn)定水平，所以PALB、TP等未見明顯降低；肝臟形態(tài)學方面，多普勒血管超聲顯示實驗組門靜脈血流速度較對照組明顯減慢，提示肝臟血流阻力增大；12周時實驗組兔肝臟HE及Masson染色均可見明顯肝細胞壞死及空泡樣脂肪變性，伴橋接樣纖維間隔形成，部分假小葉形成，考慮在肝纖維化形成同時CCl4破壞細胞線粒體及內質網(wǎng)膜穩(wěn)定性，肝細胞能量代謝障礙影響脂蛋白合成及脂質排出，導致肝細胞脂肪變性；免疫組化結果顯示實驗組12周時α-sma及Col-Ⅰ表達明顯增強，且以纖維間隔及匯管區(qū)部分尤為明顯，提示HSC大量活化成為具有促纖維化功能的肌成纖維樣細胞表型，極大促進了肝纖維化的發(fā)展。螺旋CT掃描可見肝臟實質密度降低，結合組織病理結果提示肝臟在纖維化的同時發(fā)生了脂肪變性，這也是CCl4法誘導兔肝纖維化模型的弊端之一。CCl4為劇毒藥物，劑量控制不當可導致動物產(chǎn)生嚴重不良反應，因此傳統(tǒng)造模組動物死亡率高，我們在總結傳統(tǒng)造模組經(jīng)驗的基礎上，從低劑量開始給予動物一定的適應期，同時根據(jù)不同動物對藥物反應適時調整CCl4用量，可以顯著降低動物嚴重不良反應的發(fā)生率，且8周以后雖然所有動物的注射劑量均提升至1 ml·kg-1以上，仍未見明顯的藥物過量反應。根據(jù)實驗動物的狀態(tài)調整CCl4的注射劑量，雖然可能會導致動物肝纖維化程度的不均一，但是這種劑量調節(jié)方式主要著眼于降低動物死亡率，一旦度過早期的適應階段后動物對藥物產(chǎn)生耐受，這時再根據(jù)實驗要求來調整劑量便可以誘導出成功率高且符合實驗要求的動物肝纖維化模型。

同時本實驗中也暴露出一些問題，CCl4植物油溶液誘導肝纖維化常合并一定程度的脂肪變性，考慮與CCl4作用機制及劑量濃度有關；CCl4誘導早期肝纖維化存在自發(fā)逆轉現(xiàn)象，一方面可通過改變造模時間滿足不同的實驗需求，但另一方面也使造模的不穩(wěn)定性增加。

綜上所述，本研究利用CCl4法成功誘導兔肝纖維化模型，并且通過對傳統(tǒng)造模方案進行分階段、多步驟、個體化的改良，在保證造模成功率的基礎上最大程度地降低了動物死亡率，為以肝纖維化為基礎的相關研究工作提供了可靠的動物模型誘導方案。

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Modification of liver fibrosis model of rabbit induced by carbon tetrachloride

HOU Hong-wei1，PAN Zheng1，2，CHEN Min1，XU Jia-jia3，LI Wei-min1，JI Zhen-ling1，2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofGeneralSurgery，ZhongdaHospital,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 3.DepartmentofPathology，ZhongdaHospital,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To increase experimental efficiency and animal model’s quality of fundamental research which based on liver fibrosis model of animal by modify the traditional process of carbon tetrachloride(CCl4) induced liver fibrosis of rabbit. Methods: 50 healthy male new Zealand rabbits were included in this research and divided into 2 batches on average. Rabbits in first batch(traditional batch) were separated into 2 groups: modeling group(n=21) and control group(n=4). Rabbits in modeling group were injected with 50% CCl4olive oil solution subcutaneously twice a week for 12 weeks in succession while control group were treated with the same amount of pure olive oil. Rabbits in modeling group received color Doppler ultrasound， spiral computed tomography and serum biochemical examination every 4 weeks from the beginning to 12 weeks， 7 rabbits(remanent were divided equally when rabbits died unexpected ) were sacrificed after blood drawing every 4 weeks to measure portal venous pressure(PVP) and obtained liver tissues for biopsy and immunohistochemical(IHC) staining as well as staging according the ISHAK grading system; Control group were treated with the same way with modeling group and sacrificed at 12 weeks. Modify disadvantages exposed during experiment of first batch and apply revised scheme to the second batch(modified batch). Results: Mortality of traditional patch was 42.9% and significantly higher than modified batch of 9.5%(P<0.05) and the success rate of traditional patch(57.1%) was obviously lower than that of modified batch(85.7%)，too. With progression of modeling process，ALT， AST， ALB， TP of modeling group underwent significant changes compare to control group(P<0.05); color doppler flow imaging showed the speed of portal venous blood flow of modeling group was obviously slower and CT values were significantly reduced comparing to control group; HE， Masson and IHC staining showed explicit liver fibrosis and pseudolobule could be seen， ISHAK score rised over time(1.33±0.52，1.83±0.75，4.17±0.75 of modified modeling group at 4，8，12 week respectively). Conclusion: Continuous injection of CCl4 can induce explicit liver fibrosis of rabbit. By adjust modeling process of modeling process we can reduce mortality of animals drastically and guarantee the success rate at the same time and provide useful information for research based on liver fibrosis animal models.

liver fibrosis; liver cirrhosis; rabbits; animal models; carbon tetrachloride

2015-02-09

2015-03-19

江蘇省科研基金資助項目(H201230)

侯洪偉(1989-)，男，江蘇連云港人，在讀碩士研究生。E-mail:767714726@qq.com

嵇振嶺 E-mail:zlji@me.com

侯洪偉,潘崢,陳敏,等.四氯化碳誘導兔肝纖維化模型的改良[J].東南大學學報:醫(yī)學版,2015,34(4):562-567.

R575.2; R-332

A

1671-6264(2015)04-0562-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．014