曲妥珠單抗-納米金探針的制備及對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

苗鳳真，劉琳，宋麗娜，周彥生，張宇，李蘇宜，3

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；3.安徽省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)三科，安徽 合肥 230031)

·論 著·

曲妥珠單抗-納米金探針的制備及對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

苗鳳真1，劉琳1，宋麗娜2，周彥生2，張宇2，李蘇宜1，3

(1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 南京 210009； 2.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；3.安徽省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)三科，安徽 合肥 230031)

目的:構(gòu)建新型曲妥珠單抗-納米金生物探針(herceptin-GNPs)，探尋納米靶向治療乳腺癌新方法。方法：采用檸檬酸三鈉還原法制備金納米粒子(GNPs)，通過(guò)靜電吸附作用偶聯(lián)曲妥珠單抗(herceptin)合成herceptin-GNPs；MTT法檢測(cè)GNPs、herceptin、herceptin-GNPs對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌BT474細(xì)胞體外增殖抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BT474細(xì)胞凋亡率和周期變化；蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果：GNPs水溶液澄清透亮，靜電吸附成功制備herceptin-GNPs探針。GNPs濃度在100 μg·ml-1及以下未顯示明顯抑制BT474細(xì)胞增殖作用。不同濃度herceptin和herceptin-GNPs對(duì)BT474細(xì)胞生長(zhǎng)具有劑量依賴的抑制作用；與herceptin相比，herceptin-GNPs抑制作用更強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示herceptin、herceptin-GNPs均誘導(dǎo)BT474細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，且herceptin-GNPs作用強(qiáng)于herceptin。herceptin、herceptin-GNPs均可下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，降低AKT的磷酸化水平，且herceptin-GNPs作用強(qiáng)于herceptin。結(jié)論：本研究合成的herceptin-GNPs具有良好的生物相容性，較herceptin抑制乳腺癌BT474細(xì)胞生長(zhǎng)作用更強(qiáng)，可減少herceptin給藥劑量。herceptin-GNPs可能為HER2過(guò)表達(dá)乳腺癌的靶向治療提供新方法。

乳腺癌細(xì)胞； 人表皮生長(zhǎng)因子受體-2； 曲妥珠單抗； 納米探針； 金納米粒子； 細(xì)胞凋亡

據(jù)最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界范圍內(nèi)乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率為29%、死亡率為15%，分別位于女性惡性腫瘤的第1和第2位[1]。女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率在我國(guó)也呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，目前發(fā)病率和死亡率分別位居女性惡性腫瘤的第1位和第6位[2-3]，嚴(yán)重危害女性身心健康。在所有乳腺癌患者中，20%～25%的患者人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)陽(yáng)性，HER2屬于HER家族，HER家族由4類跨膜受體酪氨酸激酶組成，包括HER1、HER2、HER3、HER4，其中HER2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，其原癌基因位于17q21，編碼跨膜酪氨酸激酶活性的生長(zhǎng)因子受體，包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域3部分[4]，通過(guò)與自身或其他HER家族受體形成二聚化，引起胞內(nèi)區(qū)域磷酸化，主要通過(guò)PI3K/AKT生存信號(hào)通路及Ras/Raf/MEK/MAPK增殖信號(hào)通路等多種信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活[5]。HER2陽(yáng)性乳腺癌是一種復(fù)雜的侵襲性惡性腫瘤，與HER2陰性患者相比，預(yù)后差，生存期縮短，對(duì)化療和內(nèi)分泌治療耐受等。曲妥珠單抗(trastuzumab，商品名：赫賽汀，herceptin)是針對(duì)HER2的高純度重組DNA衍生物的人源化單克隆抗體，是乳腺癌治療領(lǐng)域的第1個(gè)分子靶向藥物，herceptin與HER2胞外域結(jié)合后通過(guò)下列機(jī)制抑制腫瘤增殖：(1) 阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞增殖及細(xì)胞存活；(2) 抗體依賴的細(xì)胞毒作用；(3) 促進(jìn)HER2內(nèi)化，阻止截?cái)嘈虷ER2的形成；(4) 增加細(xì)胞凋亡；(5) 抑制新生血管形成[6-8]。HER2陽(yáng)性乳腺癌患者使用herceptin后顯著延長(zhǎng)了無(wú)病生存期和總生存期，但herceptin致心功能降低發(fā)生率較高，尤其發(fā)生在既往使用過(guò)蒽環(huán)類化療藥物的患者上，還有部分患者在herceptin治療1年后會(huì)出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致治療失敗。減少herceptin用量、降低毒副反應(yīng)、提高療效亟待解決，探索高效低毒的納米載體偶聯(lián)herceptin進(jìn)行靶向治療是一個(gè)新的研究方向。

隨著生物醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，生物納米載體被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。特別是金納米粒子(GNPs)由于其易合成、性能穩(wěn)定、生物相容性好、表面易于偶聯(lián)生物分子等特征，在生物成像、生物傳感器、藥物運(yùn)載及腫瘤診斷和治療等方面有重要作用[9-10]，已經(jīng)成為納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)采用檸檬酸還原法制備直徑約40 nm的GNPs，通過(guò)靜電吸附與herceptin偶聯(lián)，形成曲妥珠單抗-納米金探針(herceptin-GNPs)，探討herceptin-GNPs對(duì)HER2陽(yáng)性的乳腺癌BT474細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株

人源化乳腺癌細(xì)胞株BT474細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑

herceptin購(gòu)于美國(guó)羅氏公司，胎牛血清購(gòu)于GIBICO公司;氯金酸、檸檬酸三鈉購(gòu)于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)于南京凱基生物公司;兔抗人磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、兔抗人β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體購(gòu)于Cell Signaling公司;RIPA裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于南京碧云天生物公司。

1.1.3主要儀器

透射電鏡(日本電子株式會(huì)社，JEM-200CX)，紫外分光光度計(jì)(日本島津公司UV-3600)，動(dòng)態(tài)激光光散射儀(DLS)(Malvern儀器有限公司，RW 20 digital)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek，ELx800)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，F(xiàn)ACSCalibur)，Western電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司，164-5051)，凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司，Gel Doc XR)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1GNPs合成和表征

將100 ml 0.01%的氯金酸溶液加熱至沸騰，快速攪拌同時(shí)滴加1 ml 1%檸檬酸三鈉溶液，溶液呈紫紅色時(shí)停止加熱和攪拌，室溫冷卻得濃度為47.8 μg·ml-1(以Au計(jì))的GNPs水溶液。檢測(cè)紫外-可見(jiàn)吸收光譜，水動(dòng)力尺寸和zeta電位，并進(jìn)行透射電鏡(TEM)檢測(cè)。

1.2.2herceptin-GNPs合成與表征

1.2.2.1確定herceptin最適偶聯(lián)量 采用鹽沉淀法，取6瓶0.1 ml抗體溶液，其中抗體含量分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg，每瓶均加入1 ml GNPs水溶液，混勻，室溫靜置15 min，每瓶加入1 ml 10% NaCl水溶液，靜置2 h后觀察顏色變化。

1.2.2.2herceptin-GNPs合成 取1 ml GNPs溶液調(diào)pH至9.5，緩慢滴加30 μg herceptin(30 μl，1 mg·ml-1)迅速振蕩混勻，靜置30 min，然后加入10% BSA溶液至終濃度為1%，封閉15 min制得herceptin-GNPs溶液；2 000 r·min-1離心20 min，吸出上清，超純水重懸探針，4 ℃保存。

1.2.2.3BCA法測(cè)定抗體偶聯(lián)量 取100 μl BSA未封閉herceptin-GNPs離心后的上清液，加入1 ml BCA檢測(cè)工作液，37 ℃水浴30 min，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其562 nm處的吸光值，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比得到上清中的抗體量，換算出上清液中總抗體量，則偶聯(lián)抗體量為抗體總量減去上清液中抗體量。

1.2.2.4herceptin-GNPs的表征 取1 ml BSA未封閉的herceptin-GNPs溶液，檢測(cè)其紫外-可見(jiàn)吸收光譜，水動(dòng)力尺寸和zeta電位，并進(jìn)行TEM檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

BT474細(xì)胞采用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基RPMI-1640，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1×105ml-1接種于96孔板，每孔100 μl，細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度herceptin-GNPs和herceptin作用于BT474細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照孔和調(diào)零孔，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別孵育24、48、72 h。孵育結(jié)束后每孔加入50 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清，每孔加入150 μl DMSO，混勻。在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)量吸光值(OD值)。細(xì)胞存活率計(jì)算公式：存活率=(加藥孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。

1.5 Annexin Ⅴ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

分別用濃度為1.25、2.5、5 μg·ml-1的herceptin-GNPs和herceptin作用于BT474細(xì)胞，48 h后消化收集細(xì)胞，洗滌后用500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻，再加入5 μl Propidium Iodide(PI)，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期

分別用濃度為1.25、2.5、5 μg·ml-1的herceptin-GNPs和herceptin作用于BT474細(xì)胞，48 h后消化收集細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇4 ℃固定2 h，PBS洗去固定液。加100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μl PI混勻，4 ℃避光30 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)p-AKT和Bcl-2蛋白表達(dá)

分別用濃度為1.25、2.5、5 μg·ml-1的herceptin-GNPs和herceptin以及12.5、25 μg·ml-1的GNPs作用BT474細(xì)胞，48 h后加入細(xì)胞裂解液，于冰上充分裂解30 min，4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min。取上清測(cè)定蛋白含量后分裝，-20 ℃?zhèn)溆?。取濃度等量的各組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE變性電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，加入5%脫脂奶粉溶液封閉2 h后將PVDF膜與一抗稀釋液4 ℃孵育12 h，PVDF膜清洗后與二抗稀釋液室溫孵育2 h，清洗晾干。采用ECL顯色，拍照并用Gel-Pro32軟件進(jìn)行灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組間進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GNPs合成與表征

GNPs水溶液呈清澈透亮的紫紅色，TEM圖顯示GNPs呈近似圓形(圖1A)，單分散性良好，粒徑以40nm為中心呈正態(tài)分布(圖1B)，平均直徑為(42.1±4.5) nm，為進(jìn)一步制備herceptin-GNPs提供良好的載體。

圖1 GNPs TEM圖(A,×450 000)以及GNPs粒徑分析圖(B)

Fig 1 The TEM image of GNPs(A,×450 000)and the size distribution histogram of GNPs(B)

2.2 herceptin-GNPs的合成和表征

2.2.1herceptin最適偶聯(lián)量

采用鹽沉淀法探尋最佳抗體偶聯(lián)量，在NaCl電解質(zhì)液作用下，抗體在低于某一濃度時(shí)GNPs水溶液會(huì)產(chǎn)生聚集并沉淀而變藍(lán)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗體量為12.5 μg時(shí)探針溶液變藍(lán)(圖2)，抗體量25 μg為穩(wěn)定GNPs的最低蛋白量，標(biāo)記時(shí)蛋白最適保護(hù)量在此基礎(chǔ)上增加20%，為30 μg herceptin·(ml GNPs)-1。

圖2 偶聯(lián)herceptin最適量確定

Fig 2 Determination of the optimization amount of herceptin antibody

2.2.2herceptin-GNPs TEM表征

探針經(jīng)磷鎢酸染色，可見(jiàn)GNPs表面包覆一層清晰的抗體薄層(圖3)。

2.3 GNPs與herceptin-GNPs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜分析

紫外-可見(jiàn)吸收光譜(圖4)可見(jiàn)，GNPs紫外吸收特征峰為529.5 nm，herceptin-GNPs為536.5 nm，吸收峰紅移，并且吸收峰值降低，是因?yàn)镚NPs表面吸附herceptin導(dǎo)致。

圖3 herceptin-GNPs TEM圖，箭頭指示herceptin吸附層

Fig 3 The TEM image of herceptin-GNPs，the arrow indicates the herceptin adsorption layer

圖4 GNPs與herceptin-GNPs紫外-可見(jiàn)光譜圖

Fig 4 UV-Vis spectrum of GNPs and herceptin-GNPs

2.4 GNPs與herceptin-GNPs水動(dòng)力尺寸

DLS測(cè)得GNPs的水動(dòng)力尺寸為(50.03±2.00) nm，大于TEM尺寸，是GNPs在水溶液中周圍形成水化層所致。zeta電位(-43.3±2.35) mV，表明GNPs表面帶負(fù)電，這是由于檸檬酸三鈉還原法制備的GNPs表面殘留檸檬酸根離子。herceptin-GNPs的水動(dòng)力尺寸和zeta電位分別為(118.4±4.73) nm、(-28.43±3.26) mV，均大于GNPs的尺寸及電位，表明GNPs表面因偶聯(lián)herceptin，從而引起了探針尺寸及電荷的改變。

2.5 抗體偶聯(lián)量的測(cè)定

采用BCA法測(cè)量herceptin-GNPs中抗體偶聯(lián)量，以herceptin濃度計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)得herceptin-GNPs中抗體的平均濃度為11.3 μg·ml-1，抗體偶聯(lián)率為37.67%，即每毫升GNPs水溶液可以與11.3 μg herceptin偶聯(lián)。

通過(guò)以上表征相互印證，證實(shí)了GNPs與herceptin成功偶聯(lián)，保證了探針的有效性。

2.6 MTT法檢測(cè)體外細(xì)胞增殖抑制

不同濃度GNPs作用于BT474細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)顯示，100 μg·ml-1及以下濃度的GNPs對(duì)細(xì)胞增殖率無(wú)顯著影響(P﹥0.05)(圖5A)。探針中所用GNPs的濃度在50 μg·ml-1以下，此濃度GNPs具有良好的生物相容性。herceptin、herceptin-GNPs分別與BT474細(xì)胞作用48 h，可見(jiàn)兩者對(duì)其呈現(xiàn)劑量依賴的細(xì)胞毒作用，與單獨(dú)使用herceptin相比，在相同抗體濃度下herceptin-GNPs抑制細(xì)胞增殖作用明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖5B)。

a 與herceptin同濃度相比，P<0.01

圖5 不同濃度GNPs對(duì)BT474細(xì)胞活性影響(A)以及不同濃度herceptin-GNPs和herceptin對(duì)BT474細(xì)胞活性影響(B)

Fig 5 Effect of GNPs with different concentrations on viability of BT474 cells(A)and effect of herceptin-GNPs,herceptin with different concentrations on viability of BT474 cells(B)

2.7 herceptin和herceptin-GNPs對(duì)BT474細(xì)胞周期的影響

不同濃度herceptin作用BT474細(xì)胞48 h后阻滯細(xì)胞于G0/G1期，并隨著濃度增加阻滯在G0/G1期的細(xì)胞比例增多。經(jīng)herceptin-GNPs處理后亦阻滯細(xì)胞于G0/G1期，且較單獨(dú)應(yīng)用herceptin阻滯作用增強(qiáng)(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.8 herceptin和herceptin-GNPs對(duì)BT474細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度herceptin作用于BT474細(xì)胞48 h，細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增大而增加。herceptin-GNPs處理細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率較同濃度herceptin組明顯增加(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2、圖6)。

a 與對(duì)照組相比，P<0.05; b 與同濃度herceptin相比，P<0.05

與同濃度Herceptin比較，aP<0.05，bP<0.01

圖6 不同濃度herceptin-GNPs(A)和herceptin(B)作用48 h對(duì)BT474細(xì)胞凋亡率的影響

Fig 6 Apoptotic rate of BT474 cells under the different concentrations with herceptin-GNPs(A)and herceptin(B)for 48 h

2.9 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)p-AKT蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低濃度的GNPs對(duì)HER2下游信號(hào)蛋白p-AKT及凋亡蛋白Bcl-2未見(jiàn)明顯影響，提示GNPs細(xì)胞毒性低。隨著herceptin、herceptin-GNPs濃度增加，AKT磷酸化水平降低，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平下降，顯示兩者均對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路有抑制作用，皆可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但herceptin-GNPs下調(diào)AKT磷酸化水平和降低Bcl-2表達(dá)水平高于herceptin，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖7)。

3 討 論

隨著生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展以及多學(xué)科之間的相互交叉，生物醫(yī)學(xué)納米技術(shù)的進(jìn)步為腫瘤靶向給藥帶來(lái)了革命性的變化。腫瘤血管新生過(guò)程是一種失去正常調(diào)控的無(wú)序過(guò)程，血管基膜間隙增寬，為200～800 nm，通透性增加，正常血管內(nèi)皮間隙只有5～10 nm，且腫瘤組織缺乏正常的淋巴回流系統(tǒng)，因此這種大分子納米

圖7 不同濃度herceptin和herceptin-GNPs作用48 h對(duì)BT474細(xì)胞AKT磷酸化水平和Bcl-2蛋白表達(dá)影響

Fig 7 Western Blot analysis of expression of p-AKT and Bcl-2 in BT474 cells under the different concentrations with herceptin-GNPs and herceptin for 48 h

尺寸藥物優(yōu)先穿過(guò)腫瘤血管進(jìn)入腫瘤內(nèi)部并選擇性累積，這種增強(qiáng)的滲透滯留效應(yīng)稱為EPR效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect)[11]。herceptin靶向治療乳腺癌延長(zhǎng)了患者生存期，然而herceptin致心臟毒性事件的出現(xiàn)限制了其應(yīng)用。目前herceptin致心臟毒性的機(jī)制不清，可能是心肌細(xì)胞膜上存在HER2受體，與herceptin結(jié)合后抑制心肌細(xì)胞正常功能而導(dǎo)致心功能損害[12]。因此基于EPR效應(yīng)，結(jié)合herceptin的主動(dòng)靶向作用，通過(guò)GNPs偶聯(lián)herceptin減少用藥量、增加療效、降低毒副反應(yīng)的方法成為研究熱點(diǎn)。

GNPs由于毒性低、生物相容性好、表面易于偶聯(lián)等性質(zhì)，可用于藥物載體。本實(shí)驗(yàn)合成的GNPs平均粒徑(42.1±4.5)nm，由于表面殘留有檸檬酸根離子而帶負(fù)電荷，通過(guò)靜電吸附作用與蛋白質(zhì)的正電荷結(jié)合，并且吸附后不改變蛋白質(zhì)分子的活性，不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子變性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)靜電吸附作用將GNPs與herceptin偶聯(lián)合成herceptin-GNPs,通過(guò)吸收光譜、水動(dòng)力尺寸、zeta電位和TEM檢測(cè)，證明GNPs表面成功吸附herceptin。實(shí)驗(yàn)中GNPs濃度在100 μg·ml-1及以下，BT474細(xì)胞生存率無(wú)顯著變化，顯示良好的生物相容性。herceptin作用于HER2陽(yáng)性的BT474乳腺癌細(xì)胞48 h，抑制率與藥物濃度呈正比，herceptin-GNPs在相同濃度下較herceptin抑制率顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,后通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明herceptin-GNPs的抑制作用更好。相比herceptin單抗，herceptin-GNPs的重要特征是GNPs表面結(jié)合了多個(gè)herceptin單抗，形成了類似多價(jià)抗體的納米探針。通過(guò)herceptin主動(dòng)靶向細(xì)胞膜HER2受體，多價(jià)探針提高了與HER2受體結(jié)合的親和力，HER2受體內(nèi)吞的效率提高，通過(guò)多價(jià)抗體探針多重機(jī)制抑制細(xì)胞增殖，提高了herceptin-GNPs的治療作用。Jiang等[13]將herceptin與不同尺寸的GNPs偶聯(lián)，作用于HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株SK-BR3，結(jié)果顯示，GNPs的尺寸在40～50 nm時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制作用最好，進(jìn)一步探討了可能機(jī)制，過(guò)小和過(guò)大的herceptin-GNPs誘導(dǎo)HER2受體內(nèi)吞的效率下降，GNPs作為藥物載體具有尺寸效應(yīng)。Rathinaraj等[14]將herceptin與29 nm GNPs偶聯(lián)，作用于HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞SK-BR3，通過(guò)熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞凋亡率顯著增加，推斷是因?yàn)槭荏w介導(dǎo)的內(nèi)吞作用增強(qiáng)，herceptin內(nèi)吞效率提高，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加。本實(shí)驗(yàn)合成herceptin-GNPs作用于HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞，在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖顯示了優(yōu)越性，減少了herceptin劑量，提高了療效，說(shuō)明herceptin-GNPs可能具有良好的醫(yī)用前景。

納米粒子獨(dú)特的生物學(xué)特性可作為藥物載體，在腫瘤診斷和治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，盡管大多數(shù)納米載藥處在臨床前研究階段，但已經(jīng)有少數(shù)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[15]，我們有理由相信納米載藥體系會(huì)給腫瘤治療帶來(lái)重大突破。本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)研究支持，下一步計(jì)劃建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)一步探討herceptin-GNPs在體內(nèi)的藥物代謝分布、毒性研究及抑制效果。

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Preparation of herceptin-gold nanoprobe and its inhibitory effect on breast cancer cells

MIAO Feng-zhen1，LIU Lin1，SONG Li-na2，ZHOU Yan-sheng2，ZHANG Yu2，LI Su-yi1，3

(1.DepartmentofOncology，ZhongdaHosptital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.SchoolofBiologicalScience&MedicalEngineering，KeyLaboratoryforBiomaterialsandDevices，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 3.TheThirdDepartmentofOncology，AnhuiProvincialCancerHospital，Hefei230031，China)

Objective： To construct an innovative biocompatible nanoprobe-herceptin-gold nanoparticles(GNPs)， and to explore new targeted therapies in breast cancer. Methods: GNPs were synthesized by the classic citrate reduction method and the herceptin conjugated to GNPs by electrostatic adsorption. Setting 5 concentration gradients of GNPs from 6.25 μg·ml-1to 100 μg·ml-1， herceptin and herceptin-GNPs from 0.625 μg·ml-1to 10 μg·ml-1along with their control group to detect the cytotoxicity by MTT assay. The apoptosis， cell cycle changes were detected by flow cytometry and the expressions of p-AKT and Bcl-2 protein were detected by Western Blot， respectively. Results: The GNPs aqueous solution obtained were fuchsia and clear. The GNPs showed no cytotoxicity under the designed concentration gradients， which displayed good biocompatibility. Herceptin and herceptin-GNPs both could suppress cell growth， induce apoptosis and block cell proliferation in G0/G1phase； the latter had better effect.Moreover， both herceptin and herceptin-GNPs could inhibit the expressions of p-AKT and Bcl-2 protein， and the latter had better inhibitory effect. Conclusion: The herceptin-GNPs are biocompatible. Compared with herceptin， the herceptin-GNPs have better inhibitory effect on HER2 overexpressing breast cancer cell proliferation， which can reduce the dosage of herceptin. It would provide a nanoparticle-based targeted delivery system for the treatment of HER2 overexpressing breast cancer．

breast cancer cells； human epidermal growth factor receptor 2； trastuzumab； nanoprobes； gold nanoparticles； apoptosis

2015-03-11

2015-04-09

江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃(自然科學(xué)基金-重點(diǎn)研究專項(xiàng))項(xiàng)目(BK2011036)

苗鳳真(1988-)，女，河南濟(jì)源人，在讀碩士研究生。E-mail:fengzhen_miao@163.com

劉琳 E-mail:wenyu811@126.com；李蘇宜 E-mail:njlisuyi@sina.com

苗鳳真,劉琳,宋麗娜,等.曲妥珠單抗-納米金探針的制備及對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2015,34(4):507-513.

R737.9； R318

A

1671-6264(2015)04-0507-07

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.04．004