局部應(yīng)用脂聯(lián)素基因重組腺病毒對(duì)骨缺損修復(fù)的影響

呂雪 柳娜 杜文 李佳洋 孫玥 羅恩

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院正頜與關(guān)節(jié)外科（四川大學(xué)），成都 610041

骨缺損一般由創(chuàng)傷、感染、腫瘤切除或先天性疾病等造成，治療方法包括骨移植、組織工程技術(shù)、膜引導(dǎo)性組織再生技術(shù)、基因療法、生長(zhǎng)因子療法等。盡管骨缺損的修復(fù)已經(jīng)取得很大的成就，但仍面臨許多問(wèn)題，其治療方法也存在著不同的局限性。安全高效的骨缺損修復(fù)方法是目前研究的熱點(diǎn)。

脂聯(lián)素（adiponectin，APN）也被稱為脂肪細(xì)胞補(bǔ)體相關(guān)蛋白，抵抗素1和脂肪基因，是一種主要由脂肪組織合成和分泌的脂肪因子[1]。在不同的組織中，APN發(fā)揮著不同的作用，它與胰島素敏感度的調(diào)節(jié)、能量平衡、動(dòng)脈粥樣硬化以及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)APN與骨代謝密切相關(guān)。Lenchik等[2]發(fā)現(xiàn)，血清APN的濃度與骨密度呈負(fù)相關(guān)。也有學(xué)者[3-5]發(fā)現(xiàn)，在人類的股骨及脛骨成骨細(xì)胞表面，小鼠成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞表面，MG-63細(xì)胞株及成骨細(xì)胞株表面均有APN及其受體表達(dá)。采用不同方式將APN應(yīng)用于牽張成骨和種植體周圍成骨，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)APN有促進(jìn)成骨的作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了SD大鼠脛骨骨缺損模型，采用腺病毒載體攜帶外源基因人APN（human APN，hAPN），并將重組的腺病毒載體Ad-hAPNΕGFP局部注射于骨缺損處，探討hAPN對(duì)SD大鼠骨缺損修復(fù)的影響。

1 材料和方法

1.1 hAPN重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

含有重組hAPN目的基因的質(zhì)粒由美國(guó)Tufs大學(xué)牙醫(yī)學(xué)院Jake Chen教授提供。padTrack-CMV重組穿梭載體和pAdeasy-1重組腺病毒骨架載體由漢恒生物（上海）實(shí)驗(yàn)室提供。重組腺病毒Ad-hAPN-ΕGFP的構(gòu)建與鑒定采用張志明等[6]的方法，構(gòu)建成功后Ad-hAPN-ΕGFP病毒滴度（plaque forming unit，PFU）為每毫升1×1011個(gè)。

1.2 動(dòng)物模型建立

取36只250～280 g的SD大鼠（四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），雌雄不限。于雙側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)區(qū)縱向切開(kāi)皮膚、皮下組織和骨膜，顯露脛骨前端，在脛骨內(nèi)側(cè)面距離生長(zhǎng)板約1 mm處，用臺(tái)式慢速牙科電鉆低速鉆孔制備一直徑約2 mm的圓形骨缺損（生理鹽水沖洗降溫），深達(dá)骨髓腔，不穿通對(duì)側(cè)骨密質(zhì)。術(shù)后分層拉攏縫合傷口，0.5%聚維酮碘消毒術(shù)區(qū)。

36只大鼠72側(cè)脛骨缺損隨機(jī)分成A、B、C共3組，每組24側(cè)。A組為Ad-hAPN-ΕGFP組：取10 μL Ad-hAPN-ΕGFP病毒液用0.5 mL生理鹽水稀釋，用醫(yī)用12號(hào)注射針?lè)謩e取0.25 mL稀釋病毒液于術(shù)中注入雙側(cè)骨缺損區(qū)，術(shù)后第2天從正常皮膚處進(jìn)入，潛行于骨缺損處，再次緩慢注射相同滴度的稀釋病毒液。B組為空白腺病毒組：以不含hAPN重組基因的空白腺病毒Ad-ΕGFP作對(duì)照，術(shù)中及術(shù)后第2天采用相同方法注入相同滴度相同劑量不含hAPN重組基因的病毒液。C組為空白對(duì)照組：術(shù)中及術(shù)后第2天采用相同方法注入同等劑量的生理鹽水。3組大鼠術(shù)后立即肌肉注射青霉素抗感染，劑量為每次4.0×105U，每日2次，連續(xù)注射3 d；術(shù)后采用常規(guī)顆粒飼料飼養(yǎng)。術(shù)后第3周取材進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 骨缺損修復(fù)觀察指標(biāo)

術(shù)后1周于各組大鼠中隨機(jī)取4只，用過(guò)量麻醉注射處死，獲取骨缺損區(qū)標(biāo)本，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）。術(shù)后3周處死剩余大鼠，各組中剩余8只大鼠隨機(jī)取4只用顯微CT掃描骨缺損區(qū)，另外4只用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HΕ）染色及Masson染色以觀察組織學(xué)變化。

1.3.1 real-time PCR 無(wú)菌無(wú)酶條件下快速取出骨缺損區(qū)標(biāo)本，修整大小，剔除軟組織，生理鹽水沖洗干凈后，放入凍存管中，于液氮罐中保存待用。實(shí)驗(yàn)時(shí)取出標(biāo)本，置于研缽中，骨鉗夾碎，加入少量液氮，迅速研磨至骨塊成粉末狀，加入Trizol（寶生物工程大連有限公司）提取總RNA，按照試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及real-time PCR，檢測(cè)hAPN和成骨相關(guān)因子骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor-2，Runx2）的相對(duì)表達(dá)量。hAPN和3種成骨相關(guān)因子的引物序列見(jiàn)表1，引物由美國(guó)Life Technologies Corporation-Thermo Fisher公司合成。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3.2 顯微CT 修整標(biāo)本大小，固定于4%多聚甲醛液（Sigma公司，美國(guó)）中，用μ-CT40型顯微CT機(jī)（Scanco公司，瑞士）對(duì)標(biāo)本進(jìn)行掃描，工作電壓70 kV，工作電流114 μA，整合時(shí)間700 ms，然后用隨機(jī)軟件在配套工作站上行顯微CT數(shù)據(jù)三維重建并定量分析標(biāo)本興趣區(qū)（region of interest，ROI）內(nèi)新生骨量（與上述ROI范圍一致）。測(cè)定的新生骨參數(shù)包括骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（relative bone volume，BV/TV）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）和骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。

1.3.3 HΕ及Masson染色 標(biāo)本于4%多聚甲醛液中固定48 h后，沖洗標(biāo)本，用10%乙二胺四乙酸脫鈣液脫鈣60 d，70%～100%乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5 μm，作HΕ及Masson染色。染色后光鏡下觀察切片，采集圖像。對(duì)HΕ切片進(jìn)行定量分析，3組中隨機(jī)取標(biāo)本中心切面完整的4張組織學(xué)HΕ染色切片，在顯微鏡下取40倍視野，每張切片觀測(cè)5個(gè)視野，按新骨形成面積與視野總面積比值來(lái)比較各組間是否存在差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 12.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 real-time PCR檢測(cè)結(jié)果

real-time PCR檢測(cè)顯示：A組hAPN的表達(dá)較高，證明Ad-hAPN-ΕGFP轉(zhuǎn)染成功；而B(niǎo)、C組的PCR循環(huán)數(shù)Ct值均大于30，表示B、C兩組無(wú)hAPN的表達(dá)。成骨相關(guān)因子OCN、BMP-2及Runx2在3組中的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖1：3種成骨相關(guān)因子在3組大鼠中均有表達(dá)，A組的表達(dá)量明顯大于B、C兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而B(niǎo)、C組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 A、B、C組成骨相關(guān)因子OCN、BMP-2及Runx2的相對(duì)表達(dá)量Fig 1 Osteogenesis related factors(OCN,BMP-2,and Runx2)expression of group A,B,and C

2.2 顯微CT測(cè)試結(jié)果

對(duì)術(shù)后3周標(biāo)本的顯微CT掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，結(jié)果見(jiàn)圖2：3組的骨缺損部位均沒(méi)有形成完全的骨愈合，都存在無(wú)新骨形成的空白區(qū)域；但與B、C組相比，A組骨小梁相對(duì)致密，空白區(qū)域較少。通過(guò)選取ROI檢測(cè)各組的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th，結(jié)果見(jiàn)表2：A組各項(xiàng)參數(shù)均明顯高于B、C組（P＜0.05），而B(niǎo)、C組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。該結(jié)果提示A組成骨較B、C組明顯，成骨量更高。

圖2 骨缺損區(qū)顯微CT三維重建圖像Fig 2 Three-dimensional micro-CT images of the bone defect area

2.3 HΕ及Masson染色結(jié)果

3組大鼠術(shù)后3周骨缺損區(qū)的HΕ和Masson染色結(jié)果見(jiàn)圖3，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察可見(jiàn)各組的新骨形成情況。術(shù)后3周，各組骨缺損內(nèi)均充滿新生骨小梁。與B、C組相比，A組骨小梁數(shù)量較多，寬度較大，排列更為緊密。HΕ染色切片的定量分析結(jié)果顯示：A組骨缺損內(nèi)新骨形成面積與視野總面積比值（47.12%）大于B組（24.68%）和C組（21.95%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而B(niǎo)、C組新骨形成面積與視野總面積的比值相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 ROI內(nèi)顯微CT參數(shù)分析結(jié)果Tab 2 Micro-CT parameters of the ROI

圖3 骨缺損區(qū)的組織學(xué)染色× 100Fig 3 Histological staining of the bone defect area× 100

3 討論

本研究構(gòu)建了SD大鼠脛骨骨缺損的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將重組腺病毒Ad-hAPN-ΕGFP直接注入骨缺損區(qū)內(nèi)，術(shù)后1周real-time PCR結(jié)果顯示，APN轉(zhuǎn)染組的hAPN表達(dá)量較高，而空白腺病毒轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組無(wú)hAPN表達(dá)。術(shù)后3周的檢測(cè)結(jié)果證明了局部應(yīng)用重組腺病毒Ad-hAPN-ΕGFP可以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。

目前關(guān)于APN對(duì)成脂成骨的作用尚無(wú)定論。Shinoda等[4]認(rèn)為，通過(guò)自分泌或旁分泌產(chǎn)生的APN可以促進(jìn)骨形成，而通過(guò)內(nèi)分泌途徑產(chǎn)生的APN則抑制骨形成，另外，APN還可以通過(guò)影響胰島素通路間接地促進(jìn)成骨。Luo等[7]發(fā)現(xiàn)，APN通過(guò)APN受體/c-Jun氨基末端激酶途徑促進(jìn)人類成骨細(xì)胞增殖，通過(guò)APN受體/p38絲裂原活化蛋白激酶途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。在成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及單核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，APN通過(guò)APN受體/p38絲裂原活化蛋白激酶途徑誘導(dǎo)人類成骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體生成，抑制骨保護(hù)蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化[8]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，學(xué)者們構(gòu)建了不同的動(dòng)物模型來(lái)研究APN在體內(nèi)環(huán)境中對(duì)成骨的影響。目前大部分的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)APN可以促進(jìn)成骨，但其機(jī)制尚不清楚；推測(cè)APN主要是通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能，同時(shí)刺激血管生成而促進(jìn)成骨，還可能通過(guò)直接促進(jìn)成骨細(xì)胞分化而促進(jìn)成骨。Oshima等[9]將重組APN注入小鼠頸靜脈，發(fā)現(xiàn)重組APN可以抑制破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞堿性磷酸酶mRNA的表達(dá)和骨基質(zhì)的礦化。本課題組在前期研究中[10]證實(shí)，緩釋APN可促進(jìn)卵巢摘除大鼠羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）周圍的骨再生，并可抑制破骨細(xì)胞的功能。有學(xué)者[11-12]采用新西蘭白兔構(gòu)建了牽張成骨模型，將重組的hAPN注入牽張間隙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，間斷性使用重組hAPN可以促進(jìn)快速牽張中的骨再生。

關(guān)于APN在種植體及植入材料周圍成骨，牽張成骨及激素性股骨頭壞死模型中的作用已有較多報(bào)道，但采用基因治療促進(jìn)骨缺損修復(fù)的研究還較少。隨著基因治療的普及，腺病毒載體受到廣泛關(guān)注。該載體生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，制備純化相對(duì)容易，病毒滴度高，外源基因容量大，并且無(wú)插入突變激活癌基因的危險(xiǎn)；因此，采用重組腺病毒載體治療骨缺損具有良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了SD大鼠脛骨骨缺損模型，將Ad-hAPN-ΕGFP稀釋病毒液直接注入骨缺損，術(shù)后通過(guò)real-time PCR、顯微CT、HΕ及Masson染色檢測(cè)成骨效果。術(shù)后1周real-time PCR結(jié)果顯示hAPN轉(zhuǎn)染組成骨相關(guān)因子（OCN、BMP-2、Runx2）基因的相對(duì)表達(dá)量明顯大于空白腺病毒組及空白對(duì)照組。術(shù)后3周，顯微CT及HΕ、Masson染色顯示：與空白腺病毒組及空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染腺病毒組骨缺損中心新生骨質(zhì)明顯增多，骨質(zhì)相對(duì)成熟，板層骨所占比例也較大。本研究成功證明了局部應(yīng)用重組Ad-hAPN-ΕGFP可以促進(jìn)SD大鼠脛骨骨缺損的修復(fù)。

hAPN與大鼠APN具有高度同源性，過(guò)表達(dá)的hAPN對(duì)破骨細(xì)胞的抑制及對(duì)成骨細(xì)胞的激活可能是產(chǎn)生這一結(jié)果的原因；但是，體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多變，hAPN在骨缺損模型中是如何抑制破骨細(xì)胞、激活成骨細(xì)胞的呢？除了影響成骨及破骨平衡以外，hAPN是否同樣可以通過(guò)影響成骨和成脂平衡從而促進(jìn)成骨？既然APN主要是由脂肪細(xì)胞合成及分泌，那過(guò)表達(dá)的hAPN對(duì)脂肪細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成脂分化作用如何？這些問(wèn)題尚需進(jìn)一步研究。

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