亞硒酸鈉對海洛因吸食者T淋巴細胞增殖及其線粒體功能的影響

付青梅，張永春，張永創(chuàng)，卜英博，謝 淼，王 茜

亞硒酸鈉對海洛因吸食者T淋巴細胞增殖及其線粒體功能的影響

付青梅，張永春，張永創(chuàng)，卜英博，謝 淼，王 茜

目的 探討亞硒酸鈉對海洛因吸食者T淋巴細胞的保護作用及其與線粒體解偶聯(lián)相關指標的關系。方法 使用不同海洛因吸食年限人員外周血，提取T淋巴細胞；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測細胞生長情況，熒光分光光度法檢測細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)、細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)，用紫外分光光度計測線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)。結果 隨著吸食海洛因的時間增加，T淋巴細胞的增殖活性下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著海洛因吸食年限的增加，T淋巴細胞線粒體MPTP增加、△Ψm下降、ROS升高(P<0.05)；亞硒酸鈉可逆轉(zhuǎn)上述改變，且存在量效關系(P<0.05)。結論 長時間吸食海洛因所造成的氧化應激狀態(tài)，通過線粒體途徑對T淋巴細胞的功能和增殖情況有不利影響；亞硒酸鈉可以通過其抗氧化作用，降低ROS水平來逆轉(zhuǎn)上述過程，對T淋巴細胞具有保護作用。

亞硒酸鈉；T淋巴細胞；線粒體；線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔；活性氧；細胞線粒體膜電位

目前，國內(nèi)外部分研究提示，海洛因?qū)C體的主要影響是吸食者的尿硒濃度明顯低于健康人群[1]。硒在細胞抗氧化系統(tǒng)中占有重要位置，具有保護細胞膜結構、維持生物功能、增強機體免疫力、預防疾病等重要作用，硒能夠增強淋巴細胞的抗氧化性，使免疫細胞免受損害。還可提高機體合成IgG、IgM等抗體的能力，提高機體免疫功能，且維生素E和硒的化合物能夠降低海洛因成癮大鼠的氧自由基含量，增強其抗氧化功能[2]。線粒體作為細胞能量供應的核心細胞器，在細胞發(fā)揮其功能和調(diào)節(jié)細胞凋亡中起關鍵作用[3]。本研究選擇亞硒酸鈉作為干預因素，對海洛因吸食者外周血T淋巴細胞進行浸染，觀察亞硒酸鈉對T淋巴細胞是否具有保護作用，且與線粒體解偶聯(lián)相關指標是否具有相關性，為下一步系統(tǒng)研究積累一定技術和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 從戒毒中心隨機選擇100名男性青中年海洛因吸食者的外周血，亞硒酸鈉(Sigma-Aldrich公司，批號:NC586234759)、無鈣、鎂離子的平衡鹽溶液(D-Hank’s液，pH 7.2～7.4)、淋巴細胞分離液(天津市TBD生物技術發(fā)展中心)、RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)、小牛血清(華西醫(yī)科大學)、尼龍棉(上?；w九廠)、MTT(Sigma公司)、詹納斯綠B(索萊寶公司)、Rh123(索萊寶公司)、DCFH-DA活性氧檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1.2 方法

1.2.1 分組 100名海洛因吸食者根據(jù)入院前的綜合檢查情況，排除其他疾病，根據(jù)海洛因的吸食時間，將受試對象分為2、5、8年3個組別，實驗前告知所有受試對象該研究的目的和意義，并選擇20名健康成年男性的外周血作為對照。

1.2.2 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)的分離 采用密度梯度離心法[4]。取新鮮上述組別外周血，用D-Hank液稀釋2～3倍，充分混勻后用無菌毛細吸管吸取5～6 ml稀釋的白細胞懸液沿管壁小心緩慢地加入事先已裝有3 ml淋巴細胞分離液的10 ml離心管內(nèi)，水平式轉(zhuǎn)頭，2000 r/min離心，20 min，絕大多數(shù)PBMCs懸浮于血漿與分層液的界面上，為灰白色狀，將此層移入另一試管。用5倍以上體積的D-Hank液充分洗滌，1600 r/min，離心8 min，棄上清；1000 r/min，離心10 min，棄上清液去除混雜的血小板，所得單個核細胞重懸于含100 ml/L胎牛血清蛋白(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基中。

1.2.3 PBMCs中淋巴細胞和單核巨噬細胞的分離 采用玻璃器黏附法[5]。將分離的PBMCs細胞數(shù)調(diào)至2×106/ml置于120 mm玻璃培養(yǎng)瓶內(nèi)，充分搖晃，混勻，于50 ml/L CO2孵箱中37 ℃靜置60～90 min后，以毛細吸管小心輕吸未黏附之細胞懸液，即為去除單核細胞的淋巴細胞懸液。

1.2.4 T淋巴細胞的分離純化 采用尼龍棉柱濾過法[6]。尼龍棉以0.2 mol/L HCl浸泡6 h，再用大量蒸餾水反復沖洗，晾干。稱取尼龍棉50 mg將其仔細撕開裝填入10 ml注射器內(nèi)，高壓滅菌。尼龍棉柱高度為6 cm，可有效地過濾(2～3)×107個細胞。用D-Hank液和含200 ml/L FCS的RPMI1640培養(yǎng)基洗柱各2次，以平衡pH、溫度、排除空氣，37 ℃放置1 h。上柱前，先將平衡液放出，加入細胞數(shù)為2×107/ml的淋巴細胞懸液0.5 ml，平放尼龍棉柱，以細長的毛細滴管伸入柱內(nèi)界面加入培養(yǎng)液0.5 ml封口，將柱于37 ℃靜置孵育1 h。用預溫的培養(yǎng)液淋洗柱2～3次，流速控制在1 ml/min，收集最初的10 ml流出液，1300 r/min，離心10 min，計數(shù)細胞并調(diào)整細胞數(shù)，此即分離的純化T淋巴細胞。

1.2.5 T淋巴細胞的培養(yǎng) 將分離的T淋巴細胞培養(yǎng)于含200 ml/L FCS、2 mmol/L谷氨酰胺、20 mmol/L N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)、100 U/ml 青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞數(shù)為1×106/ml。

1.2.6 MTT法檢測細胞生長 將分離所得的T淋巴細胞按2×105個/ml接種于24孔細胞培養(yǎng)板中；加入上述培養(yǎng)基1.5 ml培養(yǎng)4 h后，部分轉(zhuǎn)入96孔板中，104個/孔，培養(yǎng)24 h后使用不同濃度的亞硒酸鈉(0.02、0.1、0.500 μmol/L)侵染，生理鹽水作為對照。干預48 h后小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入80 μl無血清培養(yǎng)基和20 μl MTT溶液(5 μg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸取孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl二甲基亞砜，低速震蕩10 min后，用酶標儀檢測490 nm處的吸光度值。吸光度值反映細胞增殖活性，其高低與細胞增殖活性成正比。

1.2.7 線粒體的提取及形態(tài)學鑒定 T淋巴細胞接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)致細胞匯合度為90%。細胞分組干預完成后，消化離心收集細胞，使用含250 mmol/L蔗糖的細胞裂解液裂解細胞，4 000 r/min離心10 min，取上清，10 000 r/min離心15 min，棄上清，收集沉淀為線粒體(注：提取線粒體步驟均于冰上進行)。將剛提取的線粒體均勻涂于載玻片上，再滴1滴0.02%詹納斯綠B染液。覆蓋玻片浸染10 min，用高倍鏡(10×40)觀察線粒體形態(tài)。實驗重復3次。

1.2.8 MPTP開放度檢測 細胞分組及刺激及線粒體的制備同上。使用測定介質(zhì)(230 mmol/L甘露醇，70 mmol/L蔗糖，3 mmol/L Hepes，pH7.4)調(diào)整線粒體蛋白含量約為1 mg/ml。使用752 N型紫外分光光度計測定540 nm波長處吸光度值。MPTP開放造成線粒體膨脹，線粒體吸光度值減少越多，說明MPTP的開放程度越大，相反，線粒體吸光度值減少越小，說明MPTP的開放程度越小。

1.2.9 △Ψm的檢測 細胞分組及刺激及線粒體的制備同上，向線粒體中加入測定介質(zhì)P(4.2787 g蔗糖，0.0034 g KH2PO4，0.0260 g HEPES，0.0567 g琥珀酸鈉溶于雙蒸餾水中，定容至50 ml，過濾除菌，4 ℃保存)。調(diào)整線粒體蛋白含量，使各組含量基本一致。加入Rh 123染色液(DMSO配制，濃度為1 mg/ml)，使其終濃度為5 μg/ml，37 ℃避光孵育30 min，使用Cary Eclipse熒光分光光度計測激發(fā)光為480 nm，發(fā)射光為525 nm的熒光強度，△Ψm與熒光強度呈負相關。

1.2.10 ROS的DCFH-DA熒光探針檢測 細胞分組處理后收集細胞，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。孵育結束后，用無血清培養(yǎng)基洗細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，再次收集細胞后，PBS重懸，用熒光分光光度汁測定2′,7′-二氯熒光黃(DCF)的熒光強度。檢測條件：激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，激發(fā)和發(fā)射波長的光柵寬度均設為5 nm。ROS含量與熒光強度呈正相關。

2 結 果

2.1 亞硒酸鈉對T淋巴細胞增殖活性的影響 與各自對照組相比，隨著亞硒酸鈉濃度的增加細胞光密度(optical density, OD)值逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；組間比較，相同劑量亞硒酸鈉作用于不同年限吸毒組后，較之對照組，細胞OD值均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明亞硒酸鈉可以上調(diào)T淋巴細胞增殖活性；而長時間吸食海洛因可使T淋巴細胞增殖活性減低(表1)。

表1 亞硒酸鈉對T淋巴細胞增殖活性的影響 (μmmol/L；±s)

注：與空白對照組比較，①P<0.05；相同劑量亞硒酸鈉組與對照組比較，②P<0.05

2.2 線粒體形態(tài)學鑒定 詹納斯綠B是線粒體的專一性染色劑，其染色原理是線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)呈藍綠色，而在周圍的細胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。經(jīng)詹納斯綠B染色后，提取的線粒體呈現(xiàn)圓形、橢圓形和桿狀的藍綠色物質(zhì)(圖1)。

圖1 線粒體的詹納斯綠B染色(10×40)

2.3 MPTP開放度檢測 與各自對照組相比，隨著亞硒酸鈉濃度的增加細胞OD值逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；組間比較，相同劑量亞硒酸鈉作用于不同年限海洛因吸食組后，較之對照組，細胞OD值均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明亞硒酸鈉可以使細胞線粒體MPTP開放度減低，對細胞線粒體起到一定保護作用；而長時間吸食海洛因可使細胞線粒體MPTP開放度增加(表2)。

2.4 △Ψm的檢測 隨著亞硒酸鈉濃度的增加，較之各自對照組，細胞熒光強度降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組間比較，相同劑量亞硒酸鈉組中，亞硒酸鈉作用于于不同年限吸毒組后，較之亞硒酸鈉所干預的正常組，細胞熒光強度增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明亞硒酸鈉可以使細胞線粒體膜電位升高，對細胞線粒體起到一定保護作用；而吸食海洛因可使細胞線粒體膜電位降低(表3)。

2.5 細胞內(nèi)ROS含量 與各自對照組相比，隨著亞硒酸鈉劑量的增加，細胞DCF熒光強度逐漸減低。相同劑量亞硒酸鈉干預的不同組間比較，隨著海洛因吸食時間的增加，細胞DCF熒光強度呈現(xiàn)增高趨勢。說明亞硒酸鈉可以使細胞ROS含量降低；而吸食海洛因可使細胞內(nèi)ROS含量升高(表4)。

表2 亞硒酸鈉對各組細胞MPTP的影響 (μmmol/L；±s)

注：與空白對照組比較，①P<0.05；相同劑量亞硒酸鈉組與對照組比較，②P<0.05

表3 亞硒酸鈉對各組細胞線粒體膜電位的影響 (μmmol/L；±s)

注：與空白對照組比較，①P<0.05；相同劑量亞硒酸鈉組與對照組比較，②P<0.05

表4 亞硒酸鈉對各組細胞內(nèi)ROS的影響 (μmmol/L；±s)

注：與空白對照組比較，①P<0.05；相同劑量亞硒酸鈉組與對照組比較，②P<0.05

3 討 論

海洛因成癮者易發(fā)各種微生物的感染，且感染后不易治愈。其艾滋病發(fā)生率、腫瘤發(fā)生率和轉(zhuǎn)移率均明顯高于普通人群，提示海洛因依賴者免疫功能紊亂或遭到嚴重損傷。相關研究提示,海洛因可以導致機體細胞免疫功能出現(xiàn)異常[7]。Simonovska 等[8]在對海洛因致成癮者體液免疫的研究中指出，海洛因?qū)Τ砂a者體液免疫功能有損傷作用，早期的報告中亦指出藥物濫用能抑制外周血T細胞的E-花環(huán)形成，毒品依賴者外周血T細胞減少，絲裂原誘導的T細胞增殖能力下降[9]。線粒體是細胞的能量中心，細胞內(nèi)大約90%的氧在線粒體被消耗，正常情況下絕大部分的氧在線粒體內(nèi)被電子傳遞鏈傳來的電子還原為水，3%～4%的氧被電子傳遞鏈漏出的電子單價還原，形成超氧陰離子，成為細胞內(nèi)ROS的主要來源，生理條件下線粒體內(nèi)存在有效的抗氧化機制，自由基可被抗氧化酶和抗氧化物清除[10]。但線粒體是機體承受體外有害因素打擊的靶點，當其功能受到影響后，正常的氧化應激平衡被打破，此時機體就會受到氧化應激損傷[11]，且線粒體功能的正常與否直接影響到細胞的增殖和凋亡[12]，增殖和凋亡的總體表現(xiàn)為對細胞增殖活性的影響。然而，T淋巴細胞是細胞免疫的核心細胞，因而可影響細胞免疫功能。

線粒體作為細胞能量供應的核心，對不同細胞發(fā)揮其功能密切相關，其功能的紊亂也將對各細胞發(fā)揮其功能造成影響。有人對海洛因的損傷機制研究時發(fā)現(xiàn)，海洛因進入人體內(nèi)后與體內(nèi)的某些酶、受體蛋白結合產(chǎn)生性質(zhì)活潑的氮自由基和其他類型自由基引發(fā)氧自由基反應和脂質(zhì)過氧化反應而造成病理性損傷[13,14]；硒能夠增強淋巴細胞的抗氧化性，使免疫細胞免受損害[15]。因此，本研究以線粒體作為研究目標點，以亞硒酸鈉作為實驗干擾條件，選擇與線粒體解偶聯(lián)功能密切相關的Δψm、MPTP、ROS作為研究對象，以期從線粒體解偶聯(lián)功能層面研究海洛因?qū)γ庖吖δ艿挠绊憽?/p>

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著亞硒酸鈉劑量的增加，T淋巴細胞增殖活性逐漸增加。而相同劑量的亞硒酸鈉干預組中，T淋巴細胞的增殖活性隨著吸食海洛因的時間增加而下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步提取T淋巴細胞線粒體后檢測細胞內(nèi)線粒體相關指標發(fā)現(xiàn)：隨著毒品吸食年限的增加，T淋巴細胞線粒體MPTP增加、△Ψm下降、ROS升高。而用不同濃度的亞硒酸鈉干預4組T淋巴細胞后發(fā)現(xiàn)，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，細胞增殖活性增加，T淋巴細胞線粒體MPTP下降、△Ψm升高、ROS下降。綜合分析出現(xiàn)以上實驗結果，其原因可能是長期吸食毒品，其通過影響細胞內(nèi)線粒體的相關功能，對機體免疫系統(tǒng)造成損害，使以T淋巴細胞為主的免疫細胞能量供應受損，甚至釋放細胞色素C，啟動線粒體介導的細胞凋亡途徑，使T淋巴細胞功能和數(shù)量下降，進而使機體免疫功能受損。具體過程可能為長期吸食毒品所造成的機體氧化應激，該應激狀態(tài)可導致細胞內(nèi)活性氧含量增加，活性氧在正常情況下是一種外源性刺激的生理調(diào)節(jié)劑。然而，活性氧的過度增加可引起細胞的氧化損傷[16]，當細胞內(nèi)活性氧水平明顯增加到一定程度時，可誘導線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔開放，進而線粒體膜電位下降，線粒體膜電位的下降又發(fā)生于經(jīng)線粒體誘導的凋亡途徑中[17]，使細胞增殖活性下降。下降的線粒體膜電位還可引起線粒體內(nèi)細胞色素C釋放，細胞色素C與胱天蛋白酶原9及胱天蛋白酶原9協(xié)同因子結合，形成凋亡小體，從而活化胱天蛋白酶3，活化的胱天蛋白酶3可清除細胞內(nèi)許多與凋亡相關的蛋白質(zhì)，最終引起細胞凋亡[18]，并使T淋巴細胞增殖活性降低。

硒是谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的重要組分，每個酶分子含有4個硒原子。GSH-Px是抗過氧化物的重要組成部分,其主要功能是阻止過氧化物和自由基的形成[19]?？梢姡钪饕纳飳W功能是構成谷胱甘肽過氧化物酶的重要成分，催化還原型谷胱甘肽變成氧化型谷胱甘肽，使有毒的過氧化物變成無毒的羥基化物。正是由于含硒的GSH-Px能催化H2O2還原,使活性氧減少。從而逆轉(zhuǎn)上述過程，最終使細胞增殖活性上升。

本研究結果表明，長時間吸食海洛因所造成的氧化應激狀態(tài)，通過細胞線粒體途徑對T淋巴細胞的增殖有不利影響。而亞硒酸鈉可以通過其抗氧化作用，降低ROS水平來逆轉(zhuǎn)上述過程，對T淋巴細胞具有保護作用。本研究由于科研經(jīng)費限制，未能檢測與線粒體功能密切相關的細胞凋亡水平，使得結果有一定局限性。在今后的研究中將進一步做凋亡方面的檢測，且本研究還處于細胞研究階段，對細胞免疫功能的影響還有待于動物實驗的進一步研究。

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(2014-08-11收稿 2014-12-23修回)

(責任編輯 岳建華)

Effects of sodium selenite on T lymphocyte proliferation and mitochondrial functioninvitro

FU Qingmei, ZHANG Yongchun, ZHANG Yongchuang,BU Yingbo,XIE Miao,and WANG Qian.

Guizhou Province Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Guiyang 550005, China

Objective To study whether or not there is protective effect of sodium selenite on T lymphocytes of heroin addicts, and if it correlates with mitochondrial uncoupling related indicators. Methods T lymphocytes extracted from peripheral blood of people who abuse heroin in different periods. Cell proliferation was detected by MTT, the levels of ROS,△Ψm were detected by fluorescence spectrophotometer, MPTP was measured by ultraviolet spectrophotometer. Results With the increased duration of heroin-abuse, T lymphocyte proliferation activity decreased significantly(P<0.05); T lymphocyte mitochondrial MPTP increased, △Ψm decreased, ROS increased(P<0.05). Sodium selenite can reverse these changes,and there is a dose-effect relationship(P<0.05). Conclusions Oxidative stress caused by prolonged heroin abuse has an adverse effect on the function and proliferation of T lymphocytesviathe mitochondrial pathway. Sodium selenite has a protective effect on T lymphocytes by its antioxidant effect, which reduces the level of ROS to reverse the above process.

sodium selenite; T lymphocytes; mitochondria; mitochondrial permeability transition pore; reactive oxygen species; mitochondrial membrane potential

貴州省科技術基金項目(黔科合J字[2012]2322號)

付青梅，本科學歷，主任醫(yī)師，E-mail:fqmdyx@163.com

550005貴陽，武警貴州總隊醫(yī)院

張永春，E-mail: anshunzyc@hotmail.com

R392.12