脂聯(lián)素對鈣化大鼠血管組織的影響

閆 亮，王 昆

脂聯(lián)素對鈣化大鼠血管組織的影響

閆 亮1，王 昆2

目的 觀察脂聯(lián)素及其受體在鈣化大鼠血管組織中的變化，探討脂聯(lián)素(adiponectin, APN)對鈣化組織的作用。方法 大鼠隨機(jī)分為正常對照組、鈣化組和脂聯(lián)素組。制備大鼠血管鈣化模型。用ELISA法測定血漿和血管組織中脂聯(lián)素的含量，用real-time PCR方法檢測組織中脂聯(lián)素與其受體adipo R1的mRNA水平，用Western blot方法檢測組織中受體adipo R1蛋白含量，測定血管中鈣含量及堿性磷酸酶活性。結(jié)果 與對照組相比，鈣化大鼠血漿和血管組織中脂聯(lián)素的含量明顯降低，分別降低了47.1% 和 57.1%；鈣化組大鼠血管組織中APN 和adipo R1 mRNA 水平較對照組有顯著降低，分別降低了65.0 %和72.0 %；鈣化大鼠的血管組織中adipo R1蛋白降低了77.2%(均P<0.01)。給予脂聯(lián)素的大鼠血管組織中鈣含量和堿性磷酸酶活性分別降低68.5%和34.8% (P<0.01)。結(jié)論 鈣化的血管組織中APN與其受體adipoR1系統(tǒng)是明顯下調(diào)，APN可明顯抑制鈣化大鼠血管組織中鈣含量和堿性磷酸酶的活性，提示APN可抑制維生素D3和尼古丁引起的血管鈣化。

血管鈣化；脂聯(lián)素；脂聯(lián)素受體

通常伴隨著衰老、糖尿病、動脈粥樣硬化、腎衰會出現(xiàn)血管鈣化，導(dǎo)致心血管疾病。相關(guān)研究證實(shí)，血管鈣化的過程是主動發(fā)生的且是可調(diào)控的，骨發(fā)育以及形成骨質(zhì)疏松的過程也是主動調(diào)節(jié)的過程，兩者有相似之處[1]。不過，當(dāng)前還未明確血管鈣化的形成機(jī)制。

脂聯(lián)素(adiponectin,APN)是由脂肪組織分泌的一種細(xì)胞因子，與心血管疾病密切相關(guān)。脂聯(lián)素通過抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)能量代謝等發(fā)揮對心血管的保護(hù)作用[2]。目前已確認(rèn)有兩種APN受體(R1和R2)。有研究發(fā)現(xiàn)，心血管組織中也有APN 受體的表達(dá)[3,4]。但鈣化血管組織中APN及其受體adipo R1 的變化及外源性APN在血管鈣化中有何作用并不明確。本研究所采用的大鼠模型經(jīng)過維生素D3及尼古丁誘導(dǎo)而形成血管鈣化，從而對發(fā)生鈣化的血管其APN和受體變化、外源性APN對鈣化血管的作用進(jìn)行觀察，以探討APN在血管鈣化中的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要試劑 雄性SD 大鼠(180～200 g)，由維通利華提供。維生素D3、VDN、ALP 試劑盒購自Sigma 公司，引物合成是北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。APN檢測試劑盒購自Invitrogen 公司?？贵wAPN受體R1購自Abcam公司。余為市售分析純產(chǎn)品。

1.2 大鼠血管鈣化模型制備 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3]制作大鼠血管鈣化模型。將36只大鼠隨機(jī)分為3組：(1)單純鈣化組(VDN，n=12)：實(shí)驗(yàn)第一天給予肌內(nèi)注射300 000 U/ kg的維生素D3，將尼古丁溶于花生油(25 mg/kg)進(jìn)行灌胃，并在9 h后第二次灌胃，之后每周2次給予0.2 ml生理鹽水尾靜脈注射；(2)鈣化+APN組(n=12)：鈣化處理后尾靜脈注射脂聯(lián)素10μg/次，每周2次，持續(xù)4周；(3)正常對照組(n=12):每周2次尾靜脈注入生理鹽水0.2 ml。

各組動物常規(guī)飼養(yǎng)4周后進(jìn)行檢測。通過腹腔注射烏拉坦1 g/kg進(jìn)行麻醉， 在腹主動脈采血，肝素抗凝，離心機(jī)分離血漿，凍存于-70 ℃ 環(huán)境下以備用。6只大鼠主動脈血漿用ELISA方法檢測APN濃度；另外，再用6只主動脈的血漿，凍存于-80 ℃條件下，取一部分通過Western blot檢測APN受體adipo R1蛋白的含量，取另外一部分進(jìn)行PCR檢測APN及其adipo R1 mRNA水平。

1.3 主動脈鈣含量測定和堿性磷酸酶活性測 取胸主動脈10～20 mg，80 ℃徹底烤干， 加入2 mol濃硝酸消化并烤干后，用去離子水(含27 nmol氯化鉀和27 μmol氯化鑭)復(fù)融，取1.5 ml 樣品，加入1%氯化鍶150 μl。用703 型原子吸收分光光度計在422.7 nm 波長下測定各管的吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出鈣含量，并換算成μmol干重組織。

取10 mg左右主動脈并添加PBS 制備成勻漿，使用離心機(jī)進(jìn)行10 min的離心，取上清液。用考馬斯亮藍(lán)法實(shí)施蛋白定量。參照Sigma ALP 測定試劑盒的使用說明書進(jìn)行心血管組織中的堿性磷酸酶活性的測定。

1.4 RNA 提取和熒光實(shí)時定量PCR 取50～100 mg血管，用QIAGEN RNA提取試劑盒提取總RNA。脂聯(lián)素的上游引物：5′-GTG TGG GAT TGG AGA CTT-3′，下游5′- TAG AGA AGA AAG CCT GTG A-3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為128 bp。 脂聯(lián)素受體adipo R1的上游引物：5′-AAC TGG ACT ATT CAG GGA-3′，下游5′- TGG TTC CAG TCT CAT CAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為198 bp。管家基因GAPDH的引物序列如下:上游5′- ATG GTG AAG GTC GGT GTG-3′，下游5′- AAC TTG CCG TGG GTA GAG-3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為161bp。運(yùn)用ABI PRISM7000 實(shí)時定量PCR 儀擴(kuò)增

PCR ，使用ABI公司的SYBR Green qPCR mix 試劑盒用于反應(yīng)體系。擴(kuò)增的條件是：95 ℃條件下進(jìn)行10 s的預(yù)變性， 95 ℃溫度條件下進(jìn)行5 s的變性，在60 ℃ 溫度條件下退火延伸20 s，反復(fù)操作40次，運(yùn)用20 μl的反應(yīng)體系。獨(dú)立進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western blot法檢測血管組織中adipo R1蛋白表達(dá)水平 蛋白樣品的提取以及蛋白的定量參照常規(guī)辦法操作。取蛋白樣品上樣60 μg，通過10%的SDS-PAGE 電泳進(jìn)行蛋白分離，蛋白質(zhì)通過半干式電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用封閉液(含3%脫脂奶粉)進(jìn)行1 h的封閉處理，添加adipo R1一抗(經(jīng)1∶1000稀釋處理)，在4 ℃條件下孵育一夜，經(jīng)3次TBST 沖洗，添加二抗(經(jīng)1∶400稀釋處理)，在室溫條件下經(jīng)過1 h的孵育，經(jīng)3次TBST 沖洗，用ECL顯色且在X 膠片曝光，在凝膠圖片分析系統(tǒng)中完成掃描分析處理及拍照。

2 結(jié) 果

2.1 鈣化大鼠血漿和血管組織中APN含量變化 對照組血漿和血管組織中APN含量分別為(2.14±0.09)μg/ml、(0.28±0.07) mg/mg pro；鈣化組血漿和血管組織中APN含量分別為(1.13±0.05)μg/ml、(0.12±0.06) mg/mg pro，和對照組比較，鈣化的大鼠血漿以及血管組織中APN含量均有明顯降低，分別降低了47.1% 和 57.1%(均P<0.01)。

2.2 鈣化大鼠血管組織中APN及其受體adipo R1 mRNA的變化 real-time PCR顯示：和對照組相比較，鈣化組的大鼠血管組織中的APN以及adipo R1 mRNA 水平降低顯著，分別降低了65.0%和72.0% (P<0.01，圖1)。

2.3 鈣化大鼠血管組織中adipo R1蛋白的變化 western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，鈣化大鼠的血管組織中adipo R1蛋白降低了77.2%(圖2)。

2.4 脂聯(lián)素對鈣化大鼠血管組織鈣含量和堿性磷酸酶活性的影響 與對照組比較， 鈣化的大鼠的血管組織中的鈣含量和堿性磷酸酶活性分別增加6.55倍和83.4%(P<0.01)。給予脂聯(lián)素的大鼠血管組織中鈣含量和堿性磷酸酶活性分別降低68.5%和34.8% (P<0.01，表1)。

圖1 鈣化大鼠血管組織中脂聯(lián)素APN與其受體adipo R1 mRNA含量的變化

圖2 鈣化大鼠血管組織中脂聯(lián)素受體adipo R1 m蛋白含量的變化

±s；n=8)

注：①與對照組比較，P<0.01；②與鈣化組比較，P<0.01

3 討 論

APN、瘦素及抵抗素等生物活性物質(zhì)是由脂肪組織分泌的，被統(tǒng)稱為脂肪因子。其中，ANP是唯一被證明與代謝綜合征、糖尿病及心血管疾病呈負(fù)相關(guān)的因子[5]。APN大量存在于血漿中， 在血漿總蛋白中所占比例達(dá)到 0.01%。以前認(rèn)為，APN因子是脂肪組織所特異表達(dá)的。然而，最新研究顯示，不但在白色的脂肪組織中有大量APN的表達(dá)，而且心肌及微血管內(nèi)皮細(xì)胞也存在APN表達(dá)。adipoR1以及adipoR2為當(dāng)前已經(jīng)克隆的兩種脂聯(lián)素受體(adiponectin recepter,adipo R)，adipoR1在骨骼肌中大量表達(dá)，肝細(xì)胞是adipoR2的主要存在場所。

在衰老過程中、糖尿病、動脈硬化、高血壓、腎病中普遍存在血管鈣化，是這些疾病所共有的病理變化，極有可能造成心血管疾病。八成血管損傷及九成冠脈疾病患者都有不同程度的血管鈣化[6]，但目前還沒有關(guān)于脂聯(lián)素及其受體在鈣化血管組織發(fā)生變化過程和在血管鈣化中它們所起作用的文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗(yàn)通過維生素D3的大劑量使用導(dǎo)致動脈組織增加了鈣含量，而維生素D3的反應(yīng)通過尼古丁的作用被增強(qiáng)，在兩者的共同作用下，動脈組織出現(xiàn)鈣超載，造成鈣沉積于動脈中膜和彈力膜，血管組織最終發(fā)生鈣化。結(jié)果顯示，鈣化大鼠的血漿和血管組織中APN的含量均有顯著降低，鈣化血管組織中APN與其受體adipoR1的mRNA表達(dá)水平明顯減低，鈣化組織中adipoR1的蛋白水平顯著下降，提示在鈣化血管組織中APN及其受體adipoR1系統(tǒng)均明顯下調(diào)。

有文獻(xiàn)[7]報道，APN通過多種信號通路，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、改善微循環(huán)及雙向調(diào)節(jié)血管新生的功能，它具體的功能有在一氧化氮( NO )的生成中起促進(jìn)作用； 對氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein ox-LDL)和高糖所誘導(dǎo)的活性氧(reactive oxygen species, ROS )的產(chǎn)生有抑制作用[8]； 腫瘤壞死因子-α( tumor necrosis factor, TNF-α)和高糖的作用下炎性反應(yīng)信號的啟動和傳遞起逆轉(zhuǎn)作用[9]； 對內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞之間的作用相互抑制；對巨噬細(xì)胞活化及轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞有抑制作用[10]；對血小板聚集起到抑制作用[11]。本實(shí)驗(yàn)給予鈣化大鼠尾靜脈注射APN 10 μg/次，每周2次，持續(xù)4周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APN可明顯抑制鈣化大鼠血管組織的鈣含量和堿性磷酸酶的活性，提示APN可以抑制維生素D3和尼古丁引起的大鼠血管鈣化。APN可能通過影響血管鈣化發(fā)病的多種調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮其抗血管鈣化的生物學(xué)效應(yīng)，在抗血管鈣化中的作用可能更復(fù)雜。就此進(jìn)行深入探討對預(yù)防在血管鈣化疾病及逆轉(zhuǎn)過程尋找或采取新治療方法非常有利。

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(2015-03-10收稿 2015-05-20修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

Influence of adiponectin on vascular calcification in rats

YAN Liang1and WANG Kun2.

1. Medical Examination Center，302nd Hospital of PLA, Beijing 100039, China；2. Department of Medical Service，General Hospital of PLA, Beijing 100853,China

Objective To observe the changes of adiponectin and its receptors in vascular calcification, and the role of adiponectin on calcified tissues. Methods Male SD rats were induced vascular calcification by vitamin D3 and nicotine, with or without adiponectin. Calcium and alkaline phosphatase (ALP) were assayed. The levels of APN in plasma and vascules were measured by ELISA. The mRNA levels of APN and adipo R1 were detected by using real-time PCR, the level of adipo R1 protein was detected by Western blotting. Results Compared with control group, the APN concentrations in plasma and calcified blood vessels decreased by 47.1% and 57.1%, respectively. The mRNA levels of APN and adipo R1 decreased by 65.0% and 72.0%.The adipo R1 protein decreased by 77.2%(P<0.01). 6.55 fold increase calcium and 83.4% increase in ALP activity were observed in calcified blood vessels than that in control group, while APN treatment down-regulated the calcium and ALP activity by 68.5% and 34.8% (P<0.01). Conclusions In calcified blood vessels, the APN and adipo R1 system are down-regulated, and APN decreases the calcium and ALP activity, suggesting that APN may have cardiovascular protection by antagonizing calcification.

vascular calcification; adiponectin; adipo R1

閆 亮，本科學(xué)歷，主管藥師，E-mail:13717790466@163.com

1.100039 北京，解放軍第302醫(yī)院體檢中心；2.100853 北京，解放軍總醫(yī)院醫(yī)療處

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