藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存及遺傳變異特性研究進(jìn)展

王晗，雷秀娟，宋娟，尹紅新，王英平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112)

1 前言

藥用植物種質(zhì)資源是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。我國(guó)雖然藥用植物資源豐富，但由于收集與保存體系不完善，造成藥用植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的丟失和縮減，給種質(zhì)創(chuàng)新、育種工作帶來很大困難。超低溫保存與就地保存、遷地保存等傳統(tǒng)方法相比，具有不受季節(jié)、土壤、氣候等自然環(huán)境條件的影響，且遺傳變異小、保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因此，超低溫保存被認(rèn)為是種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存最有效的方法，其遺傳變異特性是最受關(guān)注的問題之一。

2 藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存研究

超低溫保存是在-80℃及更低的溫度下保存種質(zhì)資源的一種方法，一般以液氮為冷源，使溫度維持在-196℃，材料在此溫度下生長(zhǎng)幾乎處于“停頓”狀態(tài)，即所有細(xì)胞分裂和代謝活力都停止，避免種質(zhì)資源在保存過程中可能造成遺傳性狀的退化和變異[1]。

2.1 材料的選擇

研究表明，材料的抗凍性以及細(xì)胞的年齡、生理狀態(tài)等因素對(duì)超低溫保存的效果有較大的影響，因此，在超低溫保存之前，材料的選擇十分重要[2]。一般情況下，細(xì)胞質(zhì)濃、無液泡、體積小的分生組織細(xì)胞的存活率高于含大液泡的成熟細(xì)胞；取生長(zhǎng)后期或?qū)?shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物能得到最高的存活率[3]。目前，常用的超低溫保存材料主要有植物幼嫩組織、組織培養(yǎng)物和植物器官3大類。

2.1.1植物幼嫩組織植物的一些幼嫩組織(如分生組織、莖尖、根尖等)細(xì)胞分裂能力強(qiáng)、分化程度高，有較高的超低溫耐性，使其在低溫保存條件下有較好的遺傳穩(wěn)定性，所以幼嫩組織是超低溫保存的理想材料[4]。目前，已成功實(shí)現(xiàn)莖尖分生組織超低溫保存的藥用植物有高山紅景天、地黃等[5，6]。芽的超低溫保存也是保存種質(zhì)資源的有效途徑，Kuoksa等[7]冷凍保存了蘇格蘭松樹的芽，其凍后存活率高達(dá)90%～100%。

2.1.2組織培養(yǎng)物愈傷組織和胚狀體是植物組織培養(yǎng)中最常見的組織培養(yǎng)物，但愈傷組織在長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)，尤其是在花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中愈傷組織的染色體會(huì)發(fā)生變異，由單倍體變?yōu)?倍體，因此，對(duì)愈傷組織的保存顯得尤為重要。目前，已成功實(shí)現(xiàn)愈傷組織超低溫保存的藥用植物有浙貝母、高山紅景天、銀杏等[8～10]。胚狀體一般是由愈傷組織分化而來，目前，已成功實(shí)現(xiàn)胚狀體超低溫保存的藥用植物有鐵皮石斛等[11]。

2.1.3植物器官超低溫保存的植物器官主要有花粉和種子兩大類?；ǚ凼侵参锓N質(zhì)的形式之一。由于花粉的生長(zhǎng)壽命時(shí)間較短，遺傳多樣性豐富，所以花粉的保存對(duì)完善種質(zhì)資源具有重要的意義。20世紀(jì)80年代以來，花粉超低溫保存開始興起。1979年，Akihama等[12]在日本果樹實(shí)驗(yàn)站建立了花粉庫，美國(guó)也相繼建立了3個(gè)花粉超低溫中心，進(jìn)行花粉超低溫保存并對(duì)保存機(jī)理進(jìn)行了探討?；ǚ鄢蜏乇４婀ぷ鲝淖畛醯拇筇镒魑镏饾u發(fā)展到經(jīng)濟(jì)作物。目前，已成功實(shí)現(xiàn)花粉超低溫保存的藥用植物有人參、西洋參、枸杞、浙貝母、商路等[13]。但花粉在超低溫保存的最長(zhǎng)時(shí)間、復(fù)蘇后花粉生活力的變化情況還有待繼續(xù)探究。

種子在形態(tài)后熟和生理后熟過程會(huì)進(jìn)一步的脫水，使含水量大大降低，是目前超低溫保存范圍最廣的植物材料，但是，自Sakai等[14]報(bào)道了關(guān)于超低溫保存的研究開始至今，大多數(shù)都是農(nóng)作物和蔬菜花卉種子的超低溫保存研究[15]，很少看到藥用植物種子超低溫保存的研究。

2.2 材料預(yù)處理

為了使材料達(dá)到超低溫保存所需要的生理特性，必須對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理，其目的是為了提高處于分裂期細(xì)胞的數(shù)目，減少細(xì)胞內(nèi)自由含水量，增強(qiáng)細(xì)胞抗寒力[16]。目前，針對(duì)材料的不同，預(yù)處理方法一般分為低溫鍛煉、繼代培養(yǎng)和預(yù)培養(yǎng)。

2.2.1低溫鍛煉低溫鍛煉，又稱冷馴化，是指在4℃左右低溫處理一段時(shí)間，激活材料的保護(hù)機(jī)制，從而提高抗低溫的能力。此外，經(jīng)過低溫鍛煉，細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性脫水，避免因細(xì)胞內(nèi)大量結(jié)冰而引起死亡[2]。

2.2.2繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)是指生長(zhǎng)的材料隔一段時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)接繼代。研究結(jié)果表明，繼代培養(yǎng)可增加植物有絲分裂細(xì)胞數(shù)，處于該時(shí)期的細(xì)胞超低溫保存后成活率較高[13，16，17]。

2.2.3預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)是指在培養(yǎng)基中加入冷凍保護(hù)劑，如二甲基亞砜(DMSO)、蔗糖、葡萄糖、水解酪蛋白、山梨醇、脫落酸等。當(dāng)培養(yǎng)基中加入這些冷凍保護(hù)劑后，可使細(xì)胞內(nèi)、外形成滲透壓，使細(xì)胞脫去部分水，提高材料的抗寒力[18，19]。

2.3 冷凍處理

冷凍處理是超低溫保存過程十分重要的步驟，隨著保存溫度的降低，細(xì)胞有形成冰晶的可能。由于植物材料含水量、生理狀態(tài)等不同，需要的冷凍方法也不相同。冷凍方法可分為快速降溫冷凍法、保護(hù)性脫水冷凍法和玻璃化冷凍法等[20]。

快速降溫冷凍法是將材料從預(yù)處理的溫度或0℃直接投入到液氮中，在快速降溫過程中大大降低了形成晶核的時(shí)間，從而避免形成細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶[16]。此方法適用于含水量少的植物材料，如種子、花粉[21～24]。

保護(hù)性脫水冷凍法包括慢速冷凍法、分步冷凍法、逐級(jí)冰凍法[20]。此方法適合于含水量較高、液泡化程度較高的愈傷組織、原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞等植物材料。慢速冷凍法是以0.5℃/min～2.0℃/min的降溫速度，從預(yù)處理溫度或0℃降到-30℃、-35℃或-40℃，之后送入液氮中。在此溫度梯度下，使植物材料有充足的時(shí)間來緩沖細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，從而降低植物材料的含水量，達(dá)到脫水效果；分步冷凍法是以0.5℃/min～4.0℃/min的降溫速度從預(yù)處理溫度或0℃降至-40℃，停留10min、1h、2h，之后再送入液氮中；逐級(jí)冷凍法是將材料經(jīng)過0℃預(yù)冷的冰凍保護(hù)劑預(yù)處理，再逐級(jí)降至-10℃、-15℃、-23℃、-35℃、-40℃等，每級(jí)溫度停留10min左右，然后送入液氮中[16]。

玻璃化冷凍法是根據(jù)玻璃化理論[25]建立的冷凍方法。該方法是在投入液氮之前，在基本培養(yǎng)基中加入高濃度的冰凍保護(hù)劑(玻璃化液)，25℃或4℃處理一段時(shí)間(一般為10min～60min)，這樣可以使細(xì)胞在接下來的降溫過程中形成玻璃化狀態(tài)，而無冰晶形成，從而避免損傷細(xì)胞，提高材料的存活率。目前，用該方法成功保存了莖尖、原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞[26～28]等。

2.4 材料的化凍洗滌及相對(duì)存活率測(cè)定

超低溫保存材料的化凍方式分為自然化凍法、溫水浴快速化凍、自來水沖洗化凍3種類型[29]。合適的化凍方法可以避免細(xì)胞內(nèi)的次生結(jié)冰，避免在化凍過程中細(xì)胞大量吸水并防止對(duì)細(xì)胞膜造成傷害。

化凍后的洗滌一般用MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog medium)徹底洗滌后，接種于繼代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1個(gè)月后，對(duì)其進(jìn)行相對(duì)成活率統(tǒng)計(jì)。超低溫保存材料細(xì)胞相對(duì)存活率的測(cè)定目前廣泛采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)還原法和二醋酸酯熒光素(FDA)染色法。

3 遺傳變異特性研究

植物種質(zhì)資源保存的目的是保證其遺傳穩(wěn)定性，控制遺傳性狀的基因不發(fā)生突變。因此，對(duì)超低溫保存后的材料的遺傳變異特性的研究是十分重要的。近年來，大量科研工作者對(duì)超低溫保存后的材料的遺傳變異特性做了大量的研究和對(duì)比分析。目前的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)3個(gè)方面的研究。

3.1 形態(tài)學(xué)方面的研究

大多數(shù)研究者認(rèn)為，超低溫保存后的材料在形態(tài)學(xué)方面沒有明顯的變化。 趙喜亭[30]在研究山藥超低溫保存的再生植株中沒有發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)特征的變化；Moukadiri等[31]研究水稻愈傷組織超低溫保存的再生后代也沒有發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)特征的變化；石思信等[32]在研究超低溫保存1年～2年的玉米花粉的后代植株中，株型、株高、葉色等具有遺傳特征的農(nóng)藝性狀與對(duì)照組沒有明顯的差異。但最近也有超低溫保存之后部分表型性狀發(fā)生變化方面的報(bào)道。

3.2 細(xì)胞學(xué)方面的研究

參照唐仙英等[33]的染色體壓片技術(shù)，艾鵬飛等[34]對(duì)超低溫保存前、后的柿和君遷子試管苗莖尖研究發(fā)現(xiàn)，其染色體條數(shù)沒有發(fā)生改變。

3.3 分子生物學(xué)方面的研究

分子生物學(xué)方面的研究主要有分子標(biāo)記、DNA甲基化和DNA含量檢測(cè)3大類。DNA分子標(biāo)記是以基本遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸(DNA)的分子差異為基礎(chǔ)的一種標(biāo)記方法。近年來，由于DNA分子標(biāo)記具有快速、準(zhǔn)確可靠、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用范圍十分廣泛，已成為分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的主要應(yīng)用技術(shù)。目前，被廣泛應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記類型主要有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)、簡(jiǎn)單重復(fù)間序列(Inter-simple sequence repeat，ISSR)、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)等。許多研究證明，超低溫保存前、后的材料沒有發(fā)生DNA序列的變異。張艷紅[35]研究秦艽超低溫保存前后的DNA未發(fā)現(xiàn)差異；Turner等[36]檢測(cè)經(jīng)過1年超低溫保存后的袋鼠花莖尖發(fā)現(xiàn)，基因組沒有發(fā)生遺傳變異。但超低溫保存后的黨參用ISSR標(biāo)記僅檢測(cè)出1.1%的變異條帶[35]。

DNA甲基化是基因組遺傳信息的重要組成部分，是物種遺傳多樣性形成和體細(xì)胞無性系變異的因素之一[37]。一些生物和非生物逆境條件下都能導(dǎo)致DNA甲基化，使其生長(zhǎng)發(fā)育不正常和形態(tài)異常，從而引起表觀性遺傳變異。何艷霞等[38]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥超低溫保存后發(fā)生了不同程度的甲基化變化。

DNA含量檢測(cè)主要采用倍性分析儀對(duì)保存后的材料進(jìn)行DNA含量分析。參照張俊娥等[39]檢測(cè)核DNA含量的方法，艾鵬飛等[34]對(duì)柿和君遷子試管苗莖尖玻璃化法超低溫保存及再生植株遺傳穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，保存前、后的葉片細(xì)胞的核DNA含量沒有發(fā)生改變。

4 現(xiàn)狀與展望

自1973年Nag和Street首次報(bào)道用液氮保存植物材料以來[3]，世界范圍內(nèi)已對(duì)數(shù)百種植物種質(zhì)開展了超低溫保存的研究。同時(shí)，超低溫保存與就地保存和遷地保存等傳統(tǒng)方法相比，具有遺傳變異小、保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是長(zhǎng)期保存種質(zhì)資源最有效的方法。我國(guó)藥用植物資源豐富，超低溫保存技術(shù)對(duì)稀有珍貴的中藥材資源的保存提供了一個(gè)良好途徑。

雖然藥用植物資源超低溫保存技術(shù)已有一定程度的發(fā)展，但是與實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用還存在一定差距，許多問題還需要進(jìn)一步研究探討，如大部分貯存材料的存活率有待提高，保存后的材料往往只是部分細(xì)胞存活，恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)間久。對(duì)于保存幾十年的材料，遺傳變異的問題也有待研究，特別是保存野生稀有植物，同時(shí)，建立各類植物的保存體系，更是今后的研究重點(diǎn)。

[1]Basu C.Gene Amplification from CryopreservedArabidopsisthalianaShoot Tips[J].Current Issues in Molecular Biology,2008,10(1/2):55-59.

[2]劉云國(guó),王曉云.果樹種質(zhì)資源超低溫保存研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究,2001,5(3):227-232.

[3]Nag K K,Street H E.Freeze Preservation of Cultured Plant Cells[J].Physiologia Plantarum,1975,34(3):254-260.

[4]肖潔凝,黃學(xué)林.莖尖和芽的超低溫保存[J].生物工程進(jìn)展,1999,19(5):46-51.

[5]劉劍鋒,閆秀峰,程云清,等.高山紅景天莖尖包埋-玻璃化法超低溫保存與植株再生[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào),2007,33(3):265-270.

[6]薛建平,張愛民,劉俊，等.玻璃化法超低溫保存地黃莖尖[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2003,11(4):430-431.

[7]Kuoksa T,Hohtola A.Freeze-preservation of Buds from Scots Pine Trees[J].Plant cell,Tissue and Organ Culture,1991,27(1):89-93.

[8]蘇新,方堅(jiān).浙貝母愈傷組織超低溫保存的研究[J].中藥材,1990,13(12):2-5.

[9]劉劍鋒,閆秀峰,程云清,等.高山紅景天愈傷組織的玻璃化法保存及植株再生[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,29(2):147-151.

[10]徐剛標(biāo),易文,李美娥.銀杏愈傷組織超低溫保存研究[J].林業(yè)科學(xué),2001,37(3):30-34.

[11]郭順星,曹文苓,張集慧,等.鐵皮石斛人工種子制作流程及發(fā)芽研究[J].中草藥,1996,27(2):105-107.

[12]Ganeshan S,Alexander M P.Fertilizing Ability of Cryopreserved Grape(VitisviniferaL.)Pollen[J].Vitis,1990,29:145-150.

[13]劉云國(guó),王曉云.果樹種質(zhì)資源超低溫保存研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究,2001,5(3):227-232.

[14]Sakai A,Otsuka K.Survival of Plant Tissue at Super-low TemperatureV.An electron Microscope Study of Ice in Cortical Cells Cooled Rapidly[J].Plant Physiology,1967,42(12):1680-1694.

[15]文彬.植物種質(zhì)資源超低溫保存概述[J].植物分類與資源學(xué)報(bào),2011,33(3):311-329.

[16]馬千全,徐立,李志英,等.植物種質(zhì)資源超低溫保存技術(shù)研究進(jìn)展[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2007,28(1):105-110.

[17]劉月學(xué),王家福,林順權(quán).超低溫保存技術(shù)在果樹種質(zhì)資源保存中的應(yīng)用[J].福建果樹,2001,117(3):25-27.

[18]Wu Y,Engelmann F,Zhao M,et al.Cryopreservation of Apple Shoot Tips:Importance of Cryopreservation Technique and of Conditioning of Donor Plants[J].Cryo Letters,1999,20(2):121-130.

[19]Vandenbussche B,Proft M.Cryopreservation of in Vitro Sugar Beet Shoot Tips Using the Encapsulation-dehydration Technique:Influence of Abscisic Acid and Cold Acclimation[J].Plant cell Reports,1998,17(10):791-793.

[20]王躍華,林抗雪,劉益麗,等.藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存研究[J].成都大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,29(4):281-284.

[21]劉燕,周慧,方標(biāo).園林花卉種子超低溫保存研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,23(4):39-44.

[22]張亞利,尚曉倩,劉燕.花粉超低溫保存研究進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(4):139-142.

[23]蘇新.浙貝母花粉超低溫保存方法的研究[J].中國(guó)中藥雜志,1991,16(7):399-401.

[24]劉劍鋒,閆秀峰,程云清,等.高山紅景天花粉的超低溫保存[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,30(6):138-140.

[25]Sakai A,Kobayashi S,Oiyama I.Cryopreservation of Nuclear Cells of Navel Orange(CitrusSinensisOsb VarBrasilensisTanaka)by Vitrification[J].Plant Cell Reports,1990,9(1):30-33.

[26]張玉進(jìn),張興國(guó),劉佩瑛,等.植物莖尖的玻璃化凍存研究[J].武漢植物學(xué)研究,1999,(S1):78-82.

[27]Langis R,Steponkus P L.Cryopreservation of Rye Protoplasts by Vitrification[J].Plant Physiology,1990,92(2):666-671.

[28]王君暉,鄭泳,嚴(yán)慶豐,等.水稻胚性懸浮細(xì)胞的玻璃化法超低溫保存和可育植株再生[J].科學(xué)通報(bào),1996,41(22):2081-2084.

[29]張亞利,尚曉倩,劉燕.花粉超低溫保存研究進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(4):140-147.

[30]趙喜亭,王苗,邵換娟,等.山藥種質(zhì)包埋玻璃化超低溫保存再生植株的穩(wěn)定性分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2012,27(1):234-238.

[31]Moukadiri O,Deming J,O’Connor JE.Phenotypic Characterization of the Progenies of Rice plants Derived from Cryopreserved Calli[J].Plant Cell Reports,1999,18(7-8):625-632.

[32]石思信,張志娥,肖建平.玉米花粉超低溫長(zhǎng)期保存對(duì)其后代農(nóng)藝性狀的影響[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué),1994,12(5):14-15.

[33]唐仙英,羅正榮.部分中國(guó)柿品種及其胚培養(yǎng)后代的染色體加倍研究[J].園藝學(xué)報(bào),2000,27(4):235-239.

[34]艾鵬飛,羅正榮.柿和君遷子試管苗莖尖玻璃化法超低溫保存及再生植株遺傳穩(wěn)定性研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,37(12):2023-2027.

[35]張延紅.秦艽和黨參的休眠芽培養(yǎng)與玻璃化超低溫保存研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[36]Turner S,Krauss S L,Bunn E,et al.Genetic Fidelity and Viability ofAnigozanthosviridisFollowing Tissue Culture,Cold Storage and Cryopreservation[J].Plant Science,2001,161(6):1099-1106.

[38]何艷霞,王子成.擬南芥幼苗超低溫保存后DNA甲基化的遺傳變異[J].植物學(xué)報(bào),2009,44(3):317-322.

[39]張俊娥,劉繼紅,鄧秀新.采用倍性分析儀鑒定柑橘愈傷組織的遺傳變異[J].遺傳學(xué)報(bào),2003,30(2):169-174.