反相高效液相色譜法測(cè)定茵山蓮軟膠囊中梔子苷含量

趙明明，宋伶俐，馬楠，王東澤，王舒航，陳宇婷，金向群，路海濱

(吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130021)

茵山蓮軟膠囊作為中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、利濕的功效，臨床上用于治療膽囊炎、胰腺炎和慢性肝炎等疾病。茵山蓮軟膠囊由甘草、梔子、板藍(lán)根、半枝蓮、五味子、茵陳6味中藥材組成，其中，梔子苷(結(jié)構(gòu)式見圖1)為梔子中的有效化學(xué)成分， 具有廣泛的保肝、利膽、抗炎、抗菌、抗腫瘤、降血糖方面的藥理作用[1]。在已發(fā)表文獻(xiàn)中未見有關(guān)茵山蓮軟膠囊含量測(cè)定報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選取梔子苷為茵山蓮軟膠囊的指標(biāo)成分，建立了梔子苷含量的反相高效液相色譜法[2]，可用于該復(fù)方制劑的質(zhì)量控制。

圖1 梔子苷結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津LC-20AT液相色譜儀(北京譜朋科技有限公司)；N2000工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息有限公司)；KQ-250D數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；JT2001電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；AB204-N分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試劑

茵山蓮軟膠囊(吉林省輝南三和制藥有限公司，批號(hào)：20121121)；梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品(吉林省藥品生物制品鑒定所)；水為三蒸水；乙腈、甲醇(色譜級(jí)，F(xiàn)isher Scientific公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取梔子苷對(duì)照品2mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制成40μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取同批次茵山蓮軟膠囊的內(nèi)容物1.5g，放入50mL錐形瓶中，用25mL環(huán)己烷溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，再向其加入50%甲醇25mL萃取，留取甲醇層液體，重復(fù)操作2次，合并，蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓浦?0mL的碘量瓶中，再精密加入甲醇至50mL，稱定重量，在20℃下超聲處理25min，放冷，再次稱定重量，用純甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

按照處方比例制備缺中藥梔子的陰性樣品，再按照“2.2”項(xiàng)的方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.4 高效液相色譜條件

選用迪馬C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，以乙腈-水(V乙腈∶V水=13∶87)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)238nm，進(jìn)樣量10μL，理論塔板數(shù)按梔子苷色譜峰計(jì)算不得低于4000。

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μL注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件分析，測(cè)定的色譜峰結(jié)果顯示，在供試品的色譜中，與對(duì)照品色譜相同位置上出現(xiàn)相同保留時(shí)間的色譜峰，且陰性溶液無(wú)干擾(圖2、圖3、圖4)。

圖2 對(duì)照品色譜圖

圖3 供試品色譜圖

圖4 陰性樣品色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制成0.0804mg/mL的梔子苷對(duì)照品溶液，再分別精密吸取對(duì)照品1mL、2mL、4mL、6mL、8mL置于10mL碘量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得不同濃度的對(duì)照品溶液。按照“2.4”項(xiàng)高效液相色譜條件，精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定(表1)。

表1梔子苷線性測(cè)定結(jié)果

Table1Theresultforthelinearrelationshipofgeniposide

梔子苷濃度(mg/mL)Theconcentrateofgeniposide梔子苷峰面積Thepeakareaofthegeniposide0.008041061204.8750.01608259640.2500.03216522444.6250.04824807312.1250.064321061204.8750.080401344518.625

以不同梔子苷對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)回歸計(jì)算：y=2 000 000x-3408，R2=0.9998。結(jié)果表明，梔子苷在0.008 04mg/mL～0.0804mg/mL范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系(圖5)。

圖5 高效液相色譜法測(cè)得的梔子苷曲線圖

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，RSD為0.2637%，表明本實(shí)驗(yàn)方法精密度良好(表2)。

表2精密度考察

Table 2 Precision inspection

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取放置0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h的供試品溶液10μL，按照“2.4”項(xiàng)高效液相色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定其色譜峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.7755%(表3)。

表3穩(wěn)定性考察

Table 3 The stability test

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次樣品內(nèi)容物6份，各1.5g，將其按照供試品溶液制備方法，再按“2.4”項(xiàng)高效液相色譜條件進(jìn)樣分析，樣品測(cè)定結(jié)果中梔子苷含量為3.86mg(n=6)，RSD為0.7925%，表明本品的測(cè)定方法重復(fù)性良好(表4)。

表4重復(fù)性考察

Table 4 Reproducible test result

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知含量的同一批號(hào)的樣品6份，再分別加入梔子苷對(duì)照品溶液適量。按“2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法操作，再按“2.4”項(xiàng)高效液相色譜條件進(jìn)樣分析，其測(cè)定結(jié)果見表5。

表5梔子苷回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

Table 5 The recovery result of the geniposide

2.10茵山蓮軟膠囊樣品中梔子苷的含量測(cè)定

取3批供試樣品，按“2.2”項(xiàng)制備供試品，精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀測(cè)定分析，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算梔子苷的含量(每粒軟膠囊重0.5g)，測(cè)定的3批樣品結(jié)果見表6。

表6茵山蓮軟膠囊中梔子苷的含量測(cè)定結(jié)果

Table6ThequantitativedeterminationofgeniposideofYinshanliansoftcapsules

編號(hào)NO梔子苷含量(mg/粒)Thecontentofgeniposide11.26121.28231.271平均 Average1.268

3 討論

3.1 萃取溶劑的選擇

在供試品制備時(shí)，本試驗(yàn)選取單因素考察法，以梔子苷含量為指標(biāo)，對(duì)萃取液中甲醇的用量、甲醇的濃度還有萃取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，梔子苷的最佳提取條件是25mL的50%甲醇萃取30min。

3.2 測(cè)定方法的選擇

梔子苷的主要測(cè)定方法有薄層掃描法、紫外法和反向高效液相色譜法[3，4]。本研究中選用了反向高效液相色譜法測(cè)定梔子苷含量，通過篩選多種流動(dòng)相系統(tǒng)，最終采取了本實(shí)驗(yàn)的高效液相色譜條件，使得梔子苷與其他成分的色譜峰完全分離了，同時(shí)該分析方法還具有簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)，可作為茵山蓮軟膠囊的質(zhì)量控制方法。

[1]張玲,孫科.梔子苷的藥理活性與結(jié)構(gòu)改造的研究進(jìn)展[J].齊魯藥事,2011,9(1):530-531.

[2]黃群蓮,唐燦,張彥燕.高效液相色譜法測(cè)定江津梔子中梔子苷含量[J].藥物鑒定,2011,20(11):21-22.

[3]萬(wàn)軍.高效液相色譜法測(cè)定鼻淵舒顆粒中梔子苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(19):79-80.

[4]蒲艷春,徐艷麗,崔靜茹.正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選梔子苷提取工藝[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(5):1029-1030.