熱休克蛋白免疫增效作用研究進(jìn)展

吳 燕，王 琦，周碧君，石 平，黃德江，程振濤＊

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.高峰鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，貴州貴安561108）

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）又稱應(yīng)激蛋白或分子伴侶，是一切生物細(xì)胞包括原核細(xì)胞及真核細(xì)胞在受到環(huán)境中物理、化學(xué)、生物、精神等因素刺激后發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生的一類在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守、由熱休克基因所編碼的伴隨細(xì)胞蛋白［1］。1962年，遺傳學(xué)家 Ritossa F［2］在研究果蠅唾液腺染色體時(shí)首次發(fā)現(xiàn)短暫的熱休克可以誘導(dǎo)唾液腺染色體出現(xiàn)3個(gè)膨突，提示該區(qū)域的基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，這也提示可能有某種蛋白合成的增加。人們將這一現(xiàn)象稱為熱休克反應(yīng)或熱休克應(yīng)答（heat shock response，HSR）。1974年，Tissieres A M H等［3］發(fā)現(xiàn)溫度升高抑制了部分正常的蛋白合成，激發(fā)染色體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，合成一組特殊蛋白質(zhì)，而且伴隨著這類蛋白的合成，細(xì)胞的其他蛋白合成卻受到抑制。由于這類蛋白的合成與熱休克反應(yīng)有關(guān)，故命名為熱休克蛋白。正常條件下，HSP在細(xì)胞內(nèi)少量存在，但在發(fā)生熱休克時(shí)其表達(dá)量明顯增加。HSP可參與維持細(xì)胞必需蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，對(duì)未折疊的新生多肽鏈進(jìn)行組裝、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)位及蛋白質(zhì)降解，細(xì)胞骨架和核骨架的穩(wěn)定，抗細(xì)胞調(diào)亡以及抗原遞呈等［4］。

1 HSP的分類

根據(jù)HSP的相對(duì)分子質(zhì)量，將其分為6個(gè)主要家族，包括大分子量 HSP家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族、小分子量HSP家族和泛素（ubiquitin）［5］。其中，小分子量 HSP家族包括HSP22、HSP23、HSP26、HSP27、HSP28、αβ-晶體蛋白等，主要分布于細(xì)胞漿、細(xì)胞核及線粒體；HSP60家族包括HSP58、HSP60和HSP65等，主要分布于線粒體；HSP70家族包括 HSP68、HSP70、HSP72、HSP73和Bip等，主要分布于細(xì)胞架、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，HSP70家族是最保守和最重要的一族，在大多數(shù)生物中含量最多，在細(xì)胞應(yīng)激后生成最顯著，家族成員也最多（共有20多種蛋白質(zhì)）；HSP90家族包括 HSP83、HSP84、HSP87、HSP90和Gp96等，主要分布于細(xì)胞漿、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體［6-7］。

2 HSP作為分子伴侶的作用

在熱休克蛋白的多種生物學(xué)功能中，HSP作為原核生物及真核生物的一種分子伴侶在蛋白質(zhì)折疊、跨膜運(yùn)輸、轉(zhuǎn)位、降解、裝配、細(xì)胞骨架及核骨架穩(wěn)定等基本功能方面發(fā)揮著重要作用［8］。目前已發(fā)現(xiàn)多種HSP具有分子伴侶效應(yīng)，在DNA疫苗領(lǐng)域研究比較多的是 HSP70、Gp96、HSP65等［9-11］。

2.1 HSP70

研究證明HSP70是熱休克蛋白中作為佐劑和保護(hù)性抗原的效果較好的一種［12-13］。HSP70具有多種功能，不僅可作為免疫佐劑、抗原載體，而且在DNA疫苗中也顯示出誘人的前景，其可顯著提高DNA疫苗的免疫原性。HSP70是高度保守的熱休克蛋白，在調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性方面起著重要的作用，且有研究發(fā)現(xiàn)，HSP70蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致毒力蛋白IcsA不能完成極性分布，從而影響志賀菌的毒力［14-15］。焦鳳萍等［9］為研究多表位重組 DNA疫苗pc（pcDNA3.1-）-P6-gBCTL-HSP70 的免 疫原 性，構(gòu)建了以P6及gBCTL為抗原表位、HSP70作為分子伴侶、pcDAN3.1為載體的單純皰疹病毒Ⅱ型（HSV-2）DNA疫苗，研究結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pc-P6-gBCTL-HSP70既可增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，又可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

2.2 Gp96

Gp96屬于HSP90家族，其最重要的作用是作為分子伴侶參與分泌型蛋白或膜蛋白的折疊或組裝，達(dá)到阻止蛋白聚集的目的［16］。同時(shí)越來(lái)越多的資料顯示Gp96具有天然免疫佐劑的作用，Gp96能非特異地激活抗原提呈細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子-α、白介素-12等細(xì)胞因子和上調(diào)CD86、CD80共刺激分子及MHC類分子的表達(dá)，給CTL提供一個(gè)促炎性細(xì)胞因子環(huán)境和共刺激分子，激發(fā)免疫應(yīng)答［16］。王彥中等［10］以乙型肝炎病毒（HBV）的主要結(jié)構(gòu)蛋白-表面蛋白（HBsAg）和核心蛋白（HBcAg）作為抗原構(gòu)建DNA疫苗，研究熱休克蛋白HSP70和Gp96作為免疫佐劑增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫水平。其利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、流式細(xì)胞內(nèi)因子染色、3H-TdR試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附等試驗(yàn)技術(shù)分析，結(jié)果顯示HSP70和Gp96可使疫苗的細(xì)胞免疫水平提高1倍～6倍，體液免疫水平提高20%～60%。

2.3 HSP65

HSP65是HSP60家族成員之一，由groEL2基因編碼，其基因全長(zhǎng)1 620bp，編碼540個(gè)氨基酸，具有高度保守性［7］。分枝桿菌HSP65既具有免疫原性又具有反應(yīng)原性，為一種良好的保護(hù)性抗原，不但是預(yù)防用疫苗的重要組成部分，也是治療學(xué)疫苗的重要靶標(biāo)蛋白。作為重要的免疫保護(hù)性抗原，HSP65DNA疫苗能夠激活感染MTB小鼠體內(nèi)10%～20%的T細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)［11］。研究顯示，HSP65與人白細(xì)胞介素2（IL-2）融合基因表達(dá)蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能夠有效抵抗肺結(jié)核感染，有望成為治療人類肺結(jié)核的疫苗［17］。李淑君等［7］通過(guò)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl-hsp65-HN組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度強(qiáng)于重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl-HN組和滅活苗組，三者都與空質(zhì)粒組和PBS組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度比較，其差異顯著，可見(jiàn)加入佐劑HSP65后的DNA質(zhì)粒誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平要高于單DNA質(zhì)粒和滅活苗。所以加入基因佐劑是提高基因疫苗免疫效果的重要手段，而提高免疫效果必不可少的就是找到正確的佐劑［18］。

3 HSP在抗原遞呈方面的作用

HSP具有活化CD8＋T細(xì)胞的能力，所以認(rèn)為其是內(nèi)源性抗原遞呈途徑的一部分。除此之外，釋放到細(xì)胞外的或體外組裝的HSP抗原肽復(fù)合物也可以像疫苗一樣被抗原遞呈細(xì)胞經(jīng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用攝取［19-20］。研究人員在一組對(duì)比自身療效的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，分別將患黑色素瘤四期的患者分為兩組，一組使用癌源性Gp96-抗原肽復(fù)合物疫苗接種治療，另一組采用化療與手術(shù)切除治療，結(jié)果顯示兩組患者存活率在統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)上沒(méi)有明顯的差異［21］。外源性抗原呈MHCⅡ類分子途徑，通過(guò)細(xì)菌源HSP作為伴侶肽進(jìn)行處理、遞呈并活化CD4＋T淋巴細(xì)胞，而其能否形成HSP與抗原肽的復(fù)合物，是細(xì)菌HSP增強(qiáng)MHCⅡ類分子遞呈途徑的關(guān)健點(diǎn)，其中增強(qiáng)抗原肽的處理與傳遞是HSP的重要功能［22］。此外，HSP的功能是通過(guò)生理系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，將其在熱休克蛋白-多肽復(fù)合物的遞呈過(guò)程中的功能有效放大［23-24］。

4 HSP在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答方面的作用

免疫原性是HSP在許多感染和自身免疫病中參與引發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫的主要因素。當(dāng)生物體受到細(xì)菌或寄生蟲(chóng)感染時(shí)，源于病原體的熱休克蛋白就是一種非常重要的抗原。目前，已發(fā)現(xiàn)很多疾病病原的免疫應(yīng)答都與熱休克蛋白有關(guān)，如結(jié)核病、子宮內(nèi)膜癌等［25-26］。美國(guó)Stressgen生物公司還將一種利用熱休克蛋白的免疫治療技術(shù)申請(qǐng)了專利和商標(biāo)（專利號(hào)：6335183）。這種技術(shù)將一種熱休克蛋白與另一種病毒、腫瘤或人類免疫缺陷病毒（HIV）抗原連接形成一種融合蛋白，這種融合蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生并強(qiáng)化特異性免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)患者的免疫力。袁靜等［27］通過(guò)研究證明，厄貝沙坦聯(lián)合洛伐他汀治療可能通過(guò)降低單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor 1α ，HIF-1α）與HSP47在腎小管間質(zhì)中的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用，其中HSP47表達(dá)增加與間質(zhì)過(guò)度積聚膠原有密切聯(lián)系。誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生熱休克蛋白，會(huì)使生物體對(duì)一些破壞性的刺激產(chǎn)生一定的抵抗，從而對(duì)一些患有慢性疾病的人可以考慮通過(guò)誘導(dǎo)其體內(nèi)HSP的產(chǎn)生來(lái)輔助治療，熱休克蛋白在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答方面的功能也是抵抗心血管和神經(jīng)損傷疾病應(yīng)考慮的條件之一。近年來(lái)已證實(shí)熱休克蛋白能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)多肽分子結(jié)合，通過(guò)抗原遞呈腫瘤細(xì)胞上的受體，將抗原肽傳遞給細(xì)胞毒T細(xì)胞誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答［28］。

5 結(jié)語(yǔ)

研究發(fā)現(xiàn)，HSP作為高度保守的“分子伴侶”，在細(xì)胞內(nèi)廣泛地參與許多復(fù)雜的功能活動(dòng)，其除與細(xì)胞的抗損傷、修復(fù)和熱耐受等生理過(guò)程相關(guān)外，也與免疫反應(yīng)的抗原遞呈和活化有著重要的相關(guān)性。HSP還參與機(jī)體抗感染、抗腫瘤和自身免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，作為一種免疫佐劑應(yīng)用于腫瘤和一些感染性疾病的疫苗或治療中［29-30］。近年來(lái)，HSP所具有的免疫增強(qiáng)作用使其在DNA疫苗研究工作中得到廣泛應(yīng)用。但其與不同抗原蛋白組合，所體現(xiàn)的作用效果、增效途徑以及增效機(jī)制不盡相同，需在具體研究工作中進(jìn)行評(píng)估分析，為疫苗增效的研究提供了新選擇和新思路。

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