適體及其在分析檢測中的應用*

富波，范卓文

(黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040)

適體(aptamer)是經(jīng)過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)篩選出來的能夠特異性結合蛋白質(zhì)或其它小分子物質(zhì)的寡核苷酸片段。指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化是由Szostak和Goldberg兩個研究小組在1990年分別獨立地提出的一種體外篩選技術［1-2］，該技術是從一個人工構建的、巨大的單鏈寡核苷酸文庫中篩選出與目標物高選擇性、高親和力結合的DNA或者RNA片段，這樣的片段被稱為核酸適體，簡稱適體。

1 適體篩選過程及特點

1.1 適體的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化篩選過程

(1)通過化學合成法構建一個巨大的、序列隨機的單鏈寡核苷酸文庫；(2)在特定的緩沖溶液體系和溫度下，將這些隨機序列與目標物進行孵育，結果只有極少數(shù)隨機序列與目標物結合；(3)通過物理的方法分離出結合物，并將隨機序列和目標物分離；(4)將分離出的隨機序列進行RT-PCR擴增；(5)擴增產(chǎn)物再與目標物一起孵育，進入下一輪篩選。如此，經(jīng)過多輪篩選，就能夠得到與目標物高選擇性、高親和力結合的適體。

1.2 適體的特點

與傳統(tǒng)的識別元素抗體相比，適體作為一種新型的識別元素具有很多獨特的特點：(1)適體與目標物結合具有高選擇性和高親和力。親和力高是因為適體是經(jīng)過多輪篩選而得到的，在篩選的過程中適體和目標物的解離常數(shù)不斷地降低。適體還具有高選擇性，可以區(qū)分目標物結構的微小差異，例如，茶堿與咖啡因結構只相差一個甲基，與可可堿相比只是甲基位置不同，而茶堿適體卻能特異識別茶堿，與其它兩種物質(zhì)無反應［3］；L-精氨酸的適體與L-精氨酸的親和力比與D-精氨酸高出12 000倍［4］。(2)適體能夠結合的目標物十分廣泛：適體不僅可以和酶、生長因子、抗體等較大的蛋白質(zhì)分子結合，還可以和金屬離子、有機染料、氨基酸、核苷酸、肽、藥物等小分子結合，甚至可以與完整的細菌、病毒和細胞結合［5］。(3)適體經(jīng)過體外篩選、化學合成而得，相比抗體而言，其生產(chǎn)效率高、成本低，純度高、組成確定。(4)適體的穩(wěn)定性好，凍成干粉后可以在室溫條件下保存數(shù)年，適當溶解后又立刻恢復其功能，并且可以反復變性、復性，重復利用。

2 適體在分析檢測中的主要應用

2.1 農(nóng)藥檢測

農(nóng)藥是一類小分子化合物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。目前農(nóng)藥殘留定性和定量分析的主要方法有各種經(jīng)典色譜法、光譜法等，還有酶抑制法和酶聯(lián)免疫分析方法。近年來，隨著適體及其篩選技術的發(fā)展，能夠識別農(nóng)藥的適體也被篩選出來，并用于農(nóng)藥的檢測。王麗等［6］采用新的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化篩選策略篩選出了甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂果4種有機磷農(nóng)藥的適體，并對其結構進行了分析，這為建立基于適體識別的農(nóng)藥分析檢測方法奠定了基礎。啶蟲脒、馬拉松以及雜環(huán)聚環(huán)芳香烴類農(nóng)藥也已經(jīng)通過基于適體識別的方法被檢測出來［7］。目前基于適體識別的農(nóng)藥檢測還都處于初級階段，未來的發(fā)展趨勢是篩選出更多與各種農(nóng)藥分子高特異性、高親和力結合的適體，結合光化學，電化學等檢測手段，建立更多的基于適體識別的農(nóng)藥分析檢測方法。

2.2 藥物檢測

藥物是人類防病、治病必不可少的武器，目前藥物的分析方法日新月異。除了傳統(tǒng)的分析方法，適體在藥物的分析檢測中也得到了廣泛的應用。目前已經(jīng)有許多應用適體識別的方法對小分子藥物進行檢測的報道，例如Teramae課題組和Xiang課題組均利用DNA雙鏈空白位點結合染料和腺苷適體建立了腺苷的分析檢測方法［8-9］，檢測限分別達2 μmol／L和6 μmol／L。雖然對腺苷的檢測靈敏度不及一些電化學檢測方法高，但是已經(jīng)優(yōu)于一般的光學檢測方法，重要的是此類方法簡單、快速、無需熒光標記。Dong課題組利用銀納米簇作為熒光信號，建立了基于適體識別的、通用的可卡因和三磷酸腺苷的分析檢測方法［10］。在該方法中，適體被分為兩個片段，每個片段都連接一段富含G堿基的DNA序列。沒有目標分析物的時候，兩個適體片段處于游離狀態(tài)，生成的銀納米簇發(fā)出微弱的熒光；加入目標分析物時，兩個適體片段與目標分析物結合，使得兩個富含G堿基的DNA序列靠近，此時生成的銀納米簇熒光強度顯著增強。此方法對可卡因和三磷酸腺苷的檢測限分別達0.1 μmol／L和0.2 μmol／L。該課題組還利用銅納米粒子作為熒光信號、適體作為識別分子，建立了基于新的檢測原理的分析檢測方法，實現(xiàn)了對三磷酸腺苷的檢測，檢測限低至28 nmol／L［11］。基于適體自組裝的原理，茶堿的分析檢測方法也被建立起來［12］。

另外，多種抗生素適體也被篩選出，包括土霉素、新霉素B、四環(huán)素、氯霉素、托普霉素、卡那霉素A和B、妥布霉素、鏈霉素、莫諾霉素、環(huán)孢霉素A、青霉素類抗生素、蒽環(huán)類抗生素等［13-14］。相應的分析檢測方法也被建立起來，例如Song等［15］應用納米金材料建立了卡那霉素的比色適體傳感器，檢測限為25 nmol／L；范婷等［16］建立了青霉素類抗生素的電化學適體傳感器，檢測限達2.81 nmol／L。這些藥物的適體多為RNA序列，與DNA適體相比較，RNA適體的保存和使用條件較高，很容易被酶解，因此限制了此類適體在分析檢測方面的應用。

2.3 金屬離子檢測

金屬離子的檢測在臨床檢驗、環(huán)境監(jiān)測等方面都有重要的作用。金屬離子適體的出現(xiàn)也為金屬離子的檢測開辟了新的途徑?；谶m體識別的K+的分析檢測方法已多有報道。K+的檢測方法多借助凝血酶適體來構建，凝血酶適體能夠折疊成G-四分體，由于G-四分體是一系列鳥嘌呤依靠氫鍵和離子之間的相互作用來穩(wěn)定，因此適體的折疊程度與K+的濃度密切相關。Nagatoishi等基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移的原理，設計了K+的熒光檢測方法［17］。Shi等建立了基于分子信標的K+熒光檢測方法［18］。高淑麗等［19］利用適體和雙鏈DNA內(nèi)插染料噻唑橙建立起K+的熒光檢測方法。在該方法中，適體先與它的互補鏈形成雙鏈，噻唑橙分子插入雙鏈結構，發(fā)出強烈熒光；加入K+后，與適體結合形成G-四分體結構，使雙鏈解離變成G-四分體結構和單鏈，從而噻唑橙分子游離出來，熒光強度大大降低。該方法可以實現(xiàn)對青霉素V甲片中K+的檢測，其結果與原子吸收法一致。此外，一些能夠和重金屬離子以及放射性離子特異性結合的適體也被篩選出來，并建立了相應的分析檢測方法，例如Pb2+，Hg2+，UO22+等［20-24］，這為有毒害金屬離子的環(huán)境監(jiān)測提供了新的思路。

2.4 微生物檢測

適體能夠結合的目標物非常廣泛，微生物也可以篩選得到相應的適體，并建立相應的分析檢測方法，有望應用于臨床檢驗和食品微生物檢驗。文曉堂［25］和王一嫻［26］等分別對適體在微生物檢測方面的研究進展進行了綜述。特別是與量子點、碳納米管等新型納米材料相結合時，基于適體識別的檢測方法的靈敏度和效率都得到提高。目前已經(jīng)建立了基于適體識別的拉熱弗朗西斯菌、空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、傷寒沙門氏桿菌、大腸埃希菌等微生物的分析檢測方法［27-31］。

2.5 蛋白質(zhì)檢測

蛋白質(zhì)是適體主要的目標物之一，因為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量比較大，有復雜的立體結構，因此篩選出來的相應適體也具有更高的選擇性和更高的親和力。至今，已經(jīng)篩選出來數(shù)百種蛋白質(zhì)的適體，其中包括細胞因子、酶、抗體等。這些蛋白質(zhì)一般與生命的正?；顒雍图膊〉陌l(fā)生有密切的聯(lián)系，這些蛋白質(zhì)的檢測對于臨床檢驗和疾病的發(fā)現(xiàn)、治療都具有重要的意義。因此基于適體識別的各種蛋白質(zhì)分析方法也迅速發(fā)展，并且與多種檢測手段相結合，例如熒光法、比色法、電化學方法等［32-38］。其中以凝血酶作為模板目標物，基于適體識別的蛋白質(zhì)檢測方法被大量報道［39-41］。另外，基于適體識別的血小板生長因子、免疫球蛋白、溶酶體等蛋白質(zhì)的分析檢測方法也被建立［42-46］。近年來，新型納米材料的出現(xiàn)也為基于適體識別的蛋白質(zhì)分析檢測方法提供了新的思路。Li等［47］應用銀納米簇建立了凝血酶的適體識別分析檢測方法，檢測限為5 nmol／L。Liu等［48］構建了基于石墨烯的分析檢測平臺，采用適體作為識別元素，不僅可以檢測蛋白質(zhì)，還可以檢測小分子和DNA片段。為了不斷提高蛋白質(zhì)的檢測靈敏度，DNA擴增技術被引用到了基于適體識別的分析檢測方法之中。Zhang等［49］建立了基于適體識別、鏈取代擴增和指數(shù)擴增的血小板生長因子的分析檢測方法，檢測限低至0.9 pmol／L。Wang等［50］建立了血小板生長因子的支鏈滾換擴增的檢測方法，檢測限低至1.6 fmol／L。

2.6 生物毒素檢測

適體還在生物毒素的分析檢測中得到應用。Gruz-Aguado等篩選得到赭曲霉素A的適體并初步應用于其分析檢測［51］。隨后，熒光、比色、電化學的和酶聯(lián)免疫的適體分析檢測赭曲霉素方法也都被建立起來［52-55］，檢測限最低可達0.07 ng／mL。黃曲霉素和微囊藻毒素的適體分析檢測方法被建立并應用于樣品檢測［56-57］。

3 結論

經(jīng)過20多年的發(fā)展，適體篩選技術得到不斷改進和完善，目標物范圍不斷拓展。適體作為一種理想的識別分子，在分析檢測方面得到了快速發(fā)展。但適體技術在分析檢測方面仍然存著一定問題和局限性，例如檢測靈敏度和分析效率有待提高。近年來，新型納米材料，例如納米金、碳納米管和石墨烯等，不斷與基于適體識別的分析檢測方法相結合，使這些方法得以改善。另外，適體的本質(zhì)是核酸，這使適體能夠很好地與核酸擴增技術相結合，這對基于適體識別的分析檢測方法靈敏度的提高有重要意義。隨著篩選技術的發(fā)展、新型適體的研究和制備、適體與新型納米材料以及核酸擴增技術的結合，適體必能在分析檢測以及更多的領域展現(xiàn)更高的活力和應用價值。

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