癢螨抗原研究進(jìn)展

王保健，朱俊楊，楊光友，鐘傳德，2，古小彬＊（.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都630；2.玉林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西玉林537000）

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癢螨抗原研究進(jìn)展

王保健1，朱俊楊1，楊光友1，鐘傳德1，2，古小彬1＊
（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都611130；2.玉林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西玉林537000）

摘 要：癢螨病是多種家養(yǎng)及野生動(dòng)物體表常見的外寄生蟲病，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。該病傳統(tǒng)的治療方法有很大的缺陷，因此，有必要采取安全的免疫學(xué)方法來(lái)控制癢螨病。為了進(jìn)一步研究癢螨抗原的功能及其特征，論文主要綜述了國(guó)內(nèi)外關(guān)于癢螨抗原基因的獲取、生物信息特性、體外表達(dá)及其重組蛋白的免疫功能，為癢螨病的早期診斷和疫苗開發(fā)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：癢螨；抗原；基因

癢螨病是分布于世界各國(guó)多種家養(yǎng)動(dòng)物及野生動(dòng)物的一種常見外寄生蟲病。動(dòng)物患癢螨病后可造成生產(chǎn)性能及畜產(chǎn)品質(zhì)量下降，消化吸收機(jī)能降低，增加飼養(yǎng)與治療成本，甚至造成動(dòng)物個(gè)體或群體大批死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)威脅野生動(dòng)物的生存與種群數(shù)量的增加［1］。

在癢螨病的診斷方面，目前我國(guó)主要通過病原學(xué)診斷方法，根據(jù)患病動(dòng)物出現(xiàn)脫毛、消瘦、出現(xiàn)痂皮等臨床特征可作初步診斷，然后分離病原顯微鏡檢才能夠做出準(zhǔn)確的診斷，但這種診斷方法僅適用于癢螨感染后期出現(xiàn)典型的臨床癥狀之后，并不適用于癢螨病的早期診斷［2］。而癢螨抗原的免疫學(xué)診斷則能夠克服這一缺陷，目前研究者已經(jīng)初步探究了癢螨的變應(yīng)原2型和肌鈣蛋白C在癢螨病早期診斷方面的作用，診斷敏感性均在90%以上，但存在特異性不高的問題，易與疥螨病形成交叉反應(yīng)，影響診斷結(jié)果。目前，防控癢螨病尚無(wú)疫苗可用，主要依靠有機(jī)磷、菊酯類和伊維菌素類等化學(xué)殺螨劑，但這些藥物的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致了螨蟲抗藥性、藥物殘留及環(huán)境污染等問題，嚴(yán)重威脅人畜健康［3-4］。因此，迫切需要人們尋找新的方法來(lái)防控該病，近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和免疫學(xué)技術(shù)的日趨成熟，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)癢螨抗原的研究進(jìn)入了一個(gè)新的階段，為癢螨病的早期診斷及相關(guān)疫苗的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

1　具酶活性抗原

具有酶活性的抗原是癢螨比較重要的一類抗原物質(zhì)，癢螨寄生后通過攝取宿主營(yíng)養(yǎng)來(lái)完成其生長(zhǎng)發(fā)育，在此過程中需要各種消化酶的作用。半胱氨酸蛋白酶就是癢螨的一種消化酶，它能夠降解宿主的結(jié)締組織，從而有助于癢螨完成其生長(zhǎng)發(fā)育［5］。此外，在癢螨寄生過程中宿主會(huì)產(chǎn)生許多氧自由基等氧化性物質(zhì)，如果不及時(shí)清除會(huì)對(duì)癢螨的存活有一定影響，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和硫氧還蛋白過氧化物酶作為癢螨的抗氧化酶則有助于氧自由基的清除從而有利于癢螨實(shí)現(xiàn)免疫逃避［6］。

1.1半胱氨酸蛋白酶

半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease，CP）是廣泛存在于動(dòng)植物以及寄生蟲中的一類含有半胱氨酸殘基的蛋白水解酶，是蛋白酶家族中最重要的成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，該酶與寄生蟲的致病力、對(duì)組織和細(xì)胞的侵襲力以及免疫逃避等多方面有關(guān)［7］。同時(shí)該酶也可作為多種寄生蟲病診斷抗原、疫苗候選分子及藥物靶標(biāo)［8］。為了探究半胱氨酸蛋白酶在癢螨免疫診斷和免疫預(yù)防方面的效果，有學(xué)者成功擴(kuò)增了綿羊癢螨的半胱氨酸蛋白酶基因序列，并對(duì)其進(jìn)行了原核表達(dá)［9］。該序列的原核表達(dá)產(chǎn)物（rPso o 1）能與綿羊癢螨的陽(yáng)性血清Ig G和Ig E抗體相識(shí)別，提示該抗原可作為綿羊癢螨的診斷抗原，但本文并未開展抗原診斷的特異性和敏感性研究。研究者還以重組蛋白（rPso o 1）作為包被抗原通過ELISA方法評(píng)價(jià)了綿羊癢螨人工感染后綿羊血清抗體的分泌情況，結(jié)果檢測(cè)到高水平的血清Ig G，但I(xiàn)g E變化不是很明顯。隨后，Nisbet等［5］得到綿羊癢螨半胱氨酸蛋白酶基因序列的完整序列，序列長(zhǎng)966bp，共編碼一段含322個(gè)氨基酸序列的多肽，分析發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列與美洲塵螨（Dermatophagoides farinae）的同源氨基酸序列具有80%的相似性。該基因的真核表達(dá)產(chǎn)物（rPso o 1）并不具有酶活性；經(jīng)免疫組化發(fā)現(xiàn)該蛋白分布于癢螨的口腔、腸道上皮及腸道分泌排泄物內(nèi)。半胱氨酸蛋白酶作為癢螨的一種分泌排泄抗原，在癢螨的免疫診斷和免疫預(yù)防方面有重要研究?jī)r(jià)值，在癢螨感染過程中半胱氨酸蛋白酶可作為分泌/排泄物進(jìn)入宿主免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

1.2谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase，GST）廣泛分布于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，是具有解毒功的酶系之一。多年研究證實(shí)谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶具有良好的免疫保護(hù)功能，是多種寄生蟲疫苗研制的候選抗原之一［10-11］。在癢螨GST的免疫學(xué)研究方面，Lee A G等［12］成功構(gòu)建了綿羊癢螨cDNA文庫(kù)并從中篩選得到長(zhǎng)660bp的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）核苷酸序列，共編碼一段含220個(gè)氨基酸序列的多肽。原核表達(dá)后的重組蛋白分子質(zhì)量為30ku，顯示出良好的酶活性。隨后，Nisbet A J等［13］通過免疫篩選技術(shù)得到綿羊癢螨（P.ovis）的GST序列。原核表達(dá)后的重組蛋白（rPoGST）顯示出良好的酶活性，將其與佐劑混合后免疫綿羊，2周后收集血清，免疫印跡發(fā)現(xiàn)重組蛋白能夠特異性識(shí)別該血清Ig G，表明重組蛋白具有良好的免疫原性。

1.3硫氧還蛋白過氧化物酶

硫氧還蛋白過氧化物酶（peroxiredoxin，Prx）是新近發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶系，廣泛存在于各種生物體內(nèi)。寄生蟲硫氧還蛋白過氧化物酶作為抗原可以誘導(dǎo)宿主Th1/Th2應(yīng)答反應(yīng)、CD4+輔助T、B細(xì)胞應(yīng)答誘導(dǎo)宿主細(xì)胞旁路激活路徑，可作為多種寄生蟲病的診斷和保護(hù)性抗原［14］。Mcnair C等［6］從綿羊癢螨的總RNA中擴(kuò)增得到618bp的硫氧還蛋白過氧化物酶基因，分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)后的重組蛋白氨基酸序列與肩突硬蜱（Ixodes scapularis）硫氧還蛋白過氧化物酶序列相似性達(dá)72%。純化后的重組蛋白顯示出良好的酶活性，這可能與癢螨的免疫逃避有關(guān)。有研究指出癢螨感染后會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞［15］。而這些細(xì)胞代謝會(huì)產(chǎn)生高度不穩(wěn)定的活性氧物質(zhì)（ROC），能夠?qū)ΠW螨造成損傷，但是癢螨不僅能夠在有氧條件下生存，而且可以在ROS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激狀態(tài)下存活并發(fā)育成熟，在此過程中Prx作為抗氧化酶發(fā)揮著重要作用，能夠保護(hù)癢螨抵抗來(lái)自宿主體內(nèi)及自身新陳代謝產(chǎn)生的ROS從而逃避宿主的免疫應(yīng)答。此外，癢螨Prx能夠識(shí)別綿羊癢螨陽(yáng)性血清IgG，也提示該抗原可作為綿羊癢螨的免疫診斷抗原。免疫組化發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要定位于癢螨的口器和胃部。

2　與癢螨運(yùn)動(dòng)相關(guān)抗原

癢螨寄生后在蟲體的機(jī)械刺激和毒素作用下，宿主皮膚組織會(huì)發(fā)生炎性浸潤(rùn)，在皮膚局部形成結(jié)節(jié)和水皰。隨著病程的發(fā)展癢螨會(huì)在宿主表皮移行，并逐步向周圍擴(kuò)散從而導(dǎo)致病情更加惡化。研究發(fā)現(xiàn)原肌球蛋白、副肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白等抗原與寄生蟲的發(fā)育和運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，有利于攝取宿主營(yíng)養(yǎng)［16］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)癢螨的原肌球蛋白、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白C等抗原進(jìn)行了相關(guān)研究。目前這些研究主要集中于對(duì)其免疫原性的初步探討方面，尚未見對(duì)其具體生物學(xué)功能的研究報(bào)道。

2.1原肌球蛋白

原肌球蛋白（Tropomyosin，Tm）由兩條平行的多肽鏈組成，呈α螺旋構(gòu)型，是細(xì)肌絲中與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其與寄生蟲的發(fā)育和運(yùn)動(dòng)有重要的關(guān)系，具有較好的免疫原性［17］。Nisbet A等［18］通過RT-PCR方法擴(kuò)增得到了長(zhǎng)852bp的綿羊癢螨（P.ovis）原肌球蛋白基因序列，共編碼一段含284個(gè)氨基酸序列的多肽，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列與美洲塵螨（D.farinae）和歐洲塵螨（D. pteronyssinus）原肌球蛋白氨基酸序列相似性分別可達(dá)98%和97%。該蛋白分布于癢螨的肌肉組織，這也提示癢螨原肌球蛋白可能與癢螨的運(yùn)動(dòng)和攝食相關(guān)。免疫印跡發(fā)現(xiàn)該重組抗原能夠與鼠抗屋塵螨原肌球蛋白血清特異性識(shí)別。

2.2副肌球蛋白

副肌球蛋白（paramyosin，PM）是存在于大多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物中的一種α螺旋蛋白質(zhì)，是多種無(wú)脊椎動(dòng)物肌細(xì)胞中粗肌絲的主要成分，在粗肌絲的組裝過程中有重要作用。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)血吸蟲和豬囊尾蚴等寄生蟲的副肌球蛋白及其基因進(jìn)行了大量研究，研究表明副肌球蛋白具有高效的免疫保護(hù)性，可作為多種抗寄生蟲感染的候選疫苗［19-20］。Nisbet A等［18］從通過綿羊癢螨的總RNA中擴(kuò)增得到2 625bp副肌球蛋白基因，共編碼一段875個(gè)氨基酸序列的多肽，分析發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列與歐洲塵螨（D.pteronyssinus）、疥螨（Sarcoptes scabiei）及熱帶無(wú)爪螨（Blomia tropicalis）的副肌球蛋白氨基酸序列相似性分別可達(dá)97%、95%、89%。有報(bào)道指出副肌球蛋白在歐洲塵螨和疥螨中體現(xiàn)出良好的免疫學(xué)價(jià)值，能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IgE［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)兔癢螨副肌球蛋白在癢螨的肌肉組織中廣泛存在，提示該蛋白可能與癢螨的攝食與運(yùn)動(dòng)有關(guān)。免疫印跡發(fā)現(xiàn)該重組蛋白能夠識(shí)別鼠抗熱帶無(wú)爪螨（B.tropicalis）陽(yáng)性血清。但論文未做免疫保護(hù)等相關(guān)研究。

2.3肌動(dòng)蛋白

肌動(dòng)蛋白（Actin）是肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分，存在于所有真核細(xì)胞中。它參與許多重要的細(xì)胞過程，如肌肉收縮、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂和胞質(zhì)分裂、囊泡和細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和建立［23］。Zheng W等［16］經(jīng)RT-PCR方法得到兔癢螨長(zhǎng)1 131bp的序列，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)其與疥螨（S. scabiei）肌動(dòng)蛋白基因具有89.26%的同源性，免疫印跡發(fā)現(xiàn)重組肌動(dòng)蛋白（rPc-act）能夠識(shí)別兔癢螨陽(yáng)性血清，表明該蛋白可用于兔癢螨的免疫診斷。免疫保護(hù)試驗(yàn)表明，雖然該重組蛋白能誘導(dǎo)免疫兔產(chǎn)生高水平的特異性IgG，但血清IgE變化并不是很明顯，而且與對(duì)照組相比該重組蛋白也不能引起兔人工感染癢螨后的感染程度出現(xiàn)明顯的變化。說(shuō)明兔癢螨肌動(dòng)蛋白并未對(duì)兔癢螨的感染形成免疫保護(hù)作用。報(bào)道還指出癢螨在寄生過程中能夠通過攝取宿主的免疫細(xì)胞和免疫球蛋白作為其食物來(lái)源，從而逃避宿主的免疫系統(tǒng)［6，24］，但這是否會(huì)影響兔癢螨肌動(dòng)蛋白的免疫保護(hù)力還有待進(jìn)一步研究。該蛋白分布于兔癢螨的全身，尤其足部以及肌肉分布較為豐富，這可能與癢螨在宿主體內(nèi)的移行與攝食有關(guān)

2.4肌鈣蛋白C

肌鈣蛋白（troponin C）是一種調(diào)節(jié)蛋白，由肌鈣蛋白T（TnT）、肌鈣蛋白I（TnI）和肌鈣蛋白C （TnC）3種亞基組成。TnC是肌鈣蛋白中唯一的Ca2+結(jié)合受體，參與調(diào)節(jié)細(xì)肌絲的活化過程，與寄生蟲的肌肉收縮有密切的關(guān)系［25］。Zheng W等［26］通過RT-PCR的方法擴(kuò)增得到長(zhǎng)46 2bp的癢螨肌鈣蛋白C基因序列，并對(duì)其進(jìn)行了原核表達(dá)。研究者通過Dot-ELISA評(píng)價(jià)了表達(dá)后的重組蛋白在癢螨感染診斷方面的價(jià)值，診斷特異性可達(dá)97.6% （83/85）。但研究也發(fā)現(xiàn)該重組蛋白也能夠識(shí)別疥螨病陽(yáng)性血清，存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng)（9/12）。肌鈣蛋白雖然可以作為癢螨病的診斷抗原，但如何提高診斷的特異性仍然是亟待解決的課題。

3　癢螨變應(yīng)原2型

變應(yīng)原2型（Pso o2）為塵螨中研究較多的一類變應(yīng)原，研究證實(shí)其具有良好的免疫活性［27-28］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者們參考?jí)m螨的變應(yīng)原2型序列對(duì)癢螨的同源基因進(jìn)行了研究。Temeyer K B等［29］通過RT-PCR的方法擴(kuò)增得到378bp的Pso o2的基因序列。序列分析表明在氨基酸序列的116位（Thr）存在一個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)，但未對(duì)該段序列進(jìn)行后續(xù)研究。隨后，Nunn F G等［30］使用ELISA方法評(píng)價(jià)了Pso o2原核表達(dá)蛋白在綿羊癢螨病早期診斷方面的價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組蛋白（rPso o2）能夠識(shí)別綿羊癢螨（P.ovis）感染早期的陽(yáng)性血清IgG，診斷特異性和敏感性分別可達(dá)90% 和93%，表明Pso o2可作為綿羊癢螨病的早期診斷抗原。癢螨病的早期診斷有十分重要的意義，因?yàn)樵诎W螨感染的早期并不會(huì)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但是癢螨的寄生會(huì)誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體和細(xì)胞因子，而這種早期診斷抗原能夠在疾病感染早期檢測(cè)到相應(yīng)抗體，從而達(dá)到早期診斷的目的，為癢螨病的防控創(chuàng)造良好的條件。

4　小結(jié)與展望

隨著對(duì)癢螨功能基因研究的不斷深入和挖掘，人們發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的癢螨抗原基因。但目前對(duì)這些抗原基因的研究主要集中在這些抗原的免疫定位與其免疫活性的初步探討方面，對(duì)于癢螨抗原的免疫應(yīng)答機(jī)制的研究與其在免疫保護(hù)方面的研究還相對(duì)較少。在癢螨診斷抗原的研究方面，雖然免疫學(xué)診斷方法的特異性和敏感性都要高于傳統(tǒng)診斷方法，但是仍然存在一定的交叉反應(yīng)。如何進(jìn)一步篩選得到高特異性的癢螨病診斷抗原仍然是后續(xù)研究值得注意的一個(gè)課題。此外，在這些抗原的體外表達(dá)方面，由于技術(shù)條件的限制，現(xiàn)行的原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物不能夠形成正確的折疊及糖基化修飾，

從而導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物免疫原性降低。因此，如何提高體外表達(dá)蛋白的免疫原性及其生物學(xué)活性是亟待解決的問題；另外，通過有效的試驗(yàn)技術(shù)方法來(lái)揭示螨類功能基因的生物學(xué)功能及相關(guān)免疫應(yīng)答方面的探究，將會(huì)是螨類疫苗研制的下一個(gè)重要課題。有理由相信，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷完善，尤其是基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，螨類疫苗的研究必定會(huì)產(chǎn)生質(zhì)的飛躍。

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Advance in Antigen of Psoroptes Mites

WANG Bao-jian1，ZHU Jun-yang1，YANG Guang-you1，ZHONG Chuan-de1，2，GU Xiao-bin1
（1.College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan，611130，China；2.Animal Disease Control Center of Yulin，Yulin，Guangxi，537000，China）

Abstract：Psoroptic acariasis is a common worldwide ectoparasitosis，which occurs in domestic and wild animals worldwide.It can cause considerable economic losses in breeding industry.However，the conventional treatment for this disease has a great disadvantage.Therefore，it is necessary to take some safe immunological methods to control it.To further investigate the function and characteristics of Psoroptes mite antigens，this review outlined the acquisition of Psoroptes mite antigen genes，their bioinformatics features，expression in vitro as well as immunological function of the recombinant proteins.This might provide useful information to develop early diagnosis and an effective vaccine against psoroptic acariasis.

Key words：Psoroptes mite；antigen；gene

作者簡(jiǎn)介：王保健（1990-），男，湖北隨州人，碩士，主要從事動(dòng)物寄生蟲病學(xué)研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31402188）；四川省教育廳項(xiàng)目（14ZB0003）

收稿日期：2015-01-12

中圖分類號(hào)：S852.746

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）07-0099-05