牛支原體致病機(jī)制研究進(jìn)展

高　鐸，孔令聰，賈博巖，王　梓，徐鳳宇，劉樹(shù)明，馬紅霞，2＊（.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春308；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春308）

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牛支原體致病機(jī)制研究進(jìn)展

高鐸1，孔令聰1，賈博巖1，王梓1，徐鳳宇1，劉樹(shù)明1，馬紅霞1，2＊
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118）

摘 要：牛支原體是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原之一，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。論文對(duì)近期國(guó)內(nèi)外關(guān)于其致病機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行梳理，以期為牛支原體肺炎的防控提供參考。對(duì)牛支原體致病機(jī)制的研究可為研制有效的疫苗和新型綠色藥物及其他防控途徑提供理論依據(jù)，進(jìn)而在臨床上有效控制牛支原體引發(fā)的疾病。論文涉及三方面內(nèi)容：一是牛支原體黏附蛋白的黏附作用；二是牛支原體在黏附基礎(chǔ)上其代謝產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的損傷和相關(guān)蛋白介導(dǎo)的宿主細(xì)胞凋亡；三是免疫學(xué)致病機(jī)制，包括黏附蛋白的免疫原性及免疫逃避機(jī)制、宿主的免疫應(yīng)答及炎癥損傷和宿主的抗炎反應(yīng)及免疫抑制機(jī)制。

關(guān)鍵詞：牛支原體；致病機(jī)制；免疫學(xué)

牛支原體（Mycoplasma bovis）是引起犢牛肺炎、關(guān)節(jié)炎和成牛乳房炎的主要病原之一，以引起呼吸系統(tǒng)疾病最為多見(jiàn)［1］。自1961年美國(guó)首次分離到牛支原體以來(lái)，全世界大多數(shù)國(guó)家都已經(jīng)發(fā)生過(guò)由牛支原體引起的相關(guān)疫情。繼2008年我國(guó)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體后，陸續(xù)證實(shí)我國(guó)部分地區(qū)發(fā)生了牛支原體肺炎疫情，給我國(guó)肉牛和奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。由于牛支原體具有在牛體持續(xù)存在和條件性致病等特點(diǎn)，50年來(lái)其引起的疾病在獸醫(yī)臨床上一直缺乏有效的防控手段，既無(wú)有效疫苗，也無(wú)特效藥物，且隨著抗生素的不合理使用，使其耐藥株出現(xiàn)的頻率呈逐年增加趨勢(shì)，給獸醫(yī)臨床治療該病增加了困難。因此，在牛支原體致病機(jī)制研究的基礎(chǔ)上研制有效的疫苗和新型綠色藥物，在臨床上控制牛支原體引發(fā)的疾病具有重要意義。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)牛支原體的致病機(jī)制開(kāi)展了一些研究，主要包括牛支原體黏附蛋白對(duì)機(jī)體的黏附、牛支原體對(duì)機(jī)體的直接損傷和免疫學(xué)致病機(jī)制三個(gè)方面。

1　牛支原體黏附蛋白對(duì)機(jī)體的黏附作用

牛支原體感染的第一步是在宿主體內(nèi)定殖，實(shí)現(xiàn)定殖的前提是黏附在相應(yīng)的靶器官表面，如豬肺炎支原體可通過(guò)p97蛋白黏附于宿主呼吸道纖毛表面，隨后蠶食纖毛，直至纖毛大面積脫落，無(wú)法排出異物及氣管黏膜產(chǎn)生的分泌物，逐漸形成肺實(shí)變，肺臟功能受損，出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀［4］。牛支原體菌體表面也存在與黏附相關(guān)的可變表面蛋白（variable surface proteins，Vsp）［5］和其他可能具有黏附作用的蛋白如pMB67、p26、p48、p68、24ku、28ku等［6］，其中牛支原體Vsp蛋白的C端具有抗原決定簇和黏附結(jié)構(gòu)，在牛支原體對(duì)宿主細(xì)胞的黏附中起關(guān)鍵作用［7］。Song Zhiqiang等［8］在牛支原體全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，篩選得到了一個(gè)與牛支原體黏附機(jī)制相關(guān)的α-烯醇化酶（α-enolase）基因，并應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了這個(gè)基因的重組蛋白。利用α-enolase重組蛋白制備了抗牛支原體α-enolase的抗體，通過(guò)配體試驗(yàn)證明該重組蛋白具有纖溶酶原結(jié)合活性，驗(yàn)證了牛支原體膜蛋白結(jié)合纖溶酶原的能力與其存在的α-enolase密切相關(guān)。其還進(jìn)一步應(yīng)用黏附與黏附抑制試驗(yàn)對(duì)牛支原體α-enolase是否和牛支原體黏附宿主細(xì)胞具有相關(guān)性進(jìn)行評(píng)定。結(jié)果表明，纖溶酶原可以明顯的加強(qiáng)牛支原體黏附呼吸道上皮細(xì)胞的能力，并且這種能力會(huì)被抗牛支原體αenolase特異性的抑制。此外，課題組也在全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了兩個(gè)與牛支原體黏附機(jī)制相關(guān)的重組蛋白vpmaX和p33，并利用激光共聚焦技術(shù)驗(yàn)證了其對(duì)牛呼吸道上皮細(xì)胞的黏附作用［9-10］?？傊じ降鞍自谂Ｖгw對(duì)宿主細(xì)胞的黏附中起主要作用，而豬肺炎支原體黏附宿主的病理學(xué)機(jī)制很可能在牛支原體的黏附機(jī)制中存在，但尚未得到證實(shí)。

2　牛支原體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷

在牛支原體黏附的基礎(chǔ)上，其代謝產(chǎn)物如核酸酶、H2O2等可對(duì)宿主細(xì)胞造成損傷。研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞攝取核酸酶后可增強(qiáng)其對(duì)各種誘導(dǎo)因素引起凋亡的敏感性［11］；Schott C等［12］和Khan L A［13］研究證實(shí)，牛支原體可以分泌大量的H2O2。Lennon S V等［14］發(fā)現(xiàn)HL-60細(xì)胞在低濃度H2O2條件下可發(fā)生凋亡，在H2O2繼續(xù)增高條件下可發(fā)生大量壞死。此外，相關(guān)研究也證實(shí)肺炎支原體（Mycoplasma pneumonia，Mp）寄生宿主呼吸道上皮細(xì)胞表面后，可通過(guò)黏附端的微管插入宿主細(xì)胞，將局部代謝產(chǎn)生的H2O2和超氧陰離子（O2-）排入胞內(nèi)，氧超載破壞細(xì)胞內(nèi)觸酶的活性，造成呼吸道上皮纖毛脫落、細(xì)胞腫脹、壞死、凋亡；且Mp產(chǎn)生的超氧陰離子能夠抑制宿主細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性，降低細(xì)胞內(nèi)H2O2的降解，導(dǎo)致宿主細(xì)胞更易遭受氧化損傷［15］。牛支原體很可能與Mp具有相似的致病機(jī)制，通過(guò)其分泌的H2O2對(duì)宿主細(xì)胞造成損傷。

牛支原體還具有可介導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的蛋白，通過(guò)介導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡而對(duì)機(jī)體造成損傷。自Tony J［16］在牛支原體上發(fā)現(xiàn)了可介導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的特異性蛋白后，Robino Patrizia等［18］在牛支原體上發(fā)現(xiàn)了具有誘導(dǎo)HL-60和U937細(xì)胞分化及凋亡功能的膜表面蛋白p48。另有研究表明穿透支原體（Mycoplasma penetrans，Mpe）和發(fā)酵支原體（Mycoplasma fermentans，Mf）的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白（lipid-associated membrane proteins，LAMPs）可被Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）識(shí)別，激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡［19-21］。

在證實(shí)牛支原體可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也有研究發(fā)現(xiàn)牛支原體尚具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。Mulongo M等［22］發(fā)現(xiàn)牛支原體可以激活NF-κB的p65亞單位，抑制caspase-9的活性，延遲自發(fā)或者腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）/星孢菌素驅(qū)動(dòng)的單核細(xì)胞凋亡，相關(guān)學(xué)者在其他支原體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)［23］。

綜上所述，牛支原體可產(chǎn)生造成細(xì)胞損傷的核酸酶、H2O2及影響宿主細(xì)胞凋亡的蛋白，從而使宿主致病。但牛支原體所產(chǎn)生的致病物質(zhì)在宿主體內(nèi)的損傷機(jī)制和NF-κB在牛支原體致病機(jī)制中的作用尚待進(jìn)一步研究。

3　免疫學(xué)致病機(jī)制

3.1牛支原體的免疫原性及免疫逃避

牛支原體因具有可被識(shí)別的不同抗原表位的抗原蛋白pMB67、Vsp、p28等而具有免疫原性。研究證實(shí)，犢牛經(jīng)呼吸道灌注牛支原體表達(dá)的VspA，48h后發(fā)生由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)［24］。劉洋等［25］在對(duì)牛支原體全基因組測(cè)序和生物分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組蛋白“p28”，并用免疫學(xué)方法驗(yàn)證其具有免疫原性，將純化后的p28重組蛋白作為抗原建立了牛支原體血清抗體間接ELISA方法并組裝成診斷試劑盒。孫文靜等［26］通過(guò)建立牛支原體全菌蛋白的雙向電泳體系，獲得多個(gè)牛支原體蛋白，其中一個(gè)經(jīng)質(zhì)譜分析和氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)確定為硫辛酰胺脫氫酶（LipDH）。經(jīng)原核重組表達(dá)，LipDH重組蛋白與牛支原體陽(yáng)性血清的Dot-ELISA及以重組蛋白作為包被抗原的ELISA鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性，證明LipDH重組蛋白具有免疫原性。

Vsp因具有較高的變異頻率而具有逃避宿主免疫的能力。Lysnyansky I等［27］發(fā)現(xiàn)牛支原體可通過(guò)ON/OFF開(kāi)關(guān)變異機(jī)制形成多樣化的支原體表面結(jié)構(gòu)，以躲避宿主免疫。該機(jī)制主要受Vsp蛋白家族基因上游區(qū)的兩個(gè)基因盒（cassette）調(diào)控，且目前已知的Vsp蛋白家族中各蛋白的cassette 1高度相似。cassette 2是Vsp蛋白家族基因的一個(gè)啟動(dòng)子，位于cassette 1的上游，該序列在重組酶的作用下能在不同Vsp蛋白間重組，以調(diào)控Vsp蛋白家族基因的轉(zhuǎn)錄功能，當(dāng)有Vsp基因的cassette 2重組為一個(gè)特定的序列時(shí)，該蛋白即可表達(dá)，當(dāng)有其他序列插入時(shí)，該Vsp基因沉默。

3.2宿主的免疫應(yīng)答及炎癥損傷

免疫應(yīng)答中所產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ的促炎作用和ROS、NO等物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損傷可能是牛支原體的重要致病機(jī)制之一。Tony J等［28］用牛支原體感染肉牛肺臟，用流式細(xì)胞儀分析感染牛T細(xì)胞亞型變化，發(fā)現(xiàn)牛支原體感染后的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和γδ-T細(xì)胞的含量明顯增高；感染后的PBMCs產(chǎn)生的IFN-γ、IL-4水平都同等程度地升高，據(jù)此判斷此感染模型兼具Th1和Th2兩種細(xì)胞反應(yīng)亞型。Francisco R等［29］發(fā)現(xiàn)，感染牛支原體的牛肺臟組織中，TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10都有所增加。Jungi T W等［30］發(fā)現(xiàn)牛支原體可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和NO。

在正常情況下，機(jī)體內(nèi)活性氧族（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。如果機(jī)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)不能有效降解ROS，就會(huì)使其在胞內(nèi)蓄積引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)表達(dá)異常，對(duì)機(jī)體造成損害。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在ROS的形成過(guò)程中起重要作用。Hermeyer K［31］證實(shí)在感染牛支原體的牛壞死部位周圍的巨噬細(xì)胞和退化的支氣管上皮細(xì)胞有大量NOS、SOD、硝基酪氨酸（nitrotyrosine，NT），且巨噬細(xì)胞分泌的NO可能降低了MHCⅡ類分子的抗原呈遞能力［32］。

總之，牛支原體感染宿主后的免疫應(yīng)答中所產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ引起的炎癥反應(yīng)，以及ROS、NO等物質(zhì)所造成的機(jī)體氧化應(yīng)激損傷可能是M.bovis的重要致病機(jī)制之一。

3.3牛支原體的抗炎作用及對(duì)機(jī)體免疫功能的抑制

因IL-4和IL-10等抗炎細(xì)胞因子過(guò)量釋放所造成的機(jī)體過(guò)于強(qiáng)烈的內(nèi)源性抗炎反應(yīng)被稱為代償性抗炎反應(yīng)綜合征（CARS）［33］。CARS及牛支原體對(duì)機(jī)體免疫功能的抑制可以使宿主免疫功能降低和易感染性增加。Jacques van der Merwe等［34］通過(guò)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)證實(shí)，正常生長(zhǎng)和經(jīng)熱處理死亡的牛支原體均可以感染所有PBMCs并抑制其增殖，但并不影響CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和γδ-T細(xì)胞分泌IFN-γ，認(rèn)為牛支原體是通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞增殖來(lái)降低機(jī)體免疫水平的。Rodríguez F等［29］證實(shí)感染牛支原體的牛肺臟組織中IL-10有所增加。Mulongo M等［22］也研究發(fā)現(xiàn)牛支原體感染后的單核細(xì)胞不能產(chǎn)生TNF-α，且IL-10的含量增高，并推測(cè)牛支原體可能是通過(guò)TLR2和TLR6介導(dǎo)激活NF-κB的。Tony J等［7］發(fā)現(xiàn)牛支原體可分泌一種具有免疫抑制活性的多肽，能降低細(xì)胞分裂素介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖作用，從而減輕宿主的免疫反應(yīng)，并且驗(yàn)證其體外重組蛋白亦能降低刀豆素介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，該多肽的N末端與VspL蛋白C末端的26個(gè)氨基酸具有84%的同源性。Thomas C B等［35］通過(guò)化學(xué)發(fā)光法發(fā)現(xiàn)牛支原體能抑制蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活劑佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）誘導(dǎo)的呼吸暴發(fā)，從而抑制細(xì)胞氧化代謝活性及氧自由基的形成能力。PKC能通過(guò)細(xì)胞膜結(jié)合NADPH氧化酶的磷酸化作用引發(fā)呼吸暴發(fā)，產(chǎn)生大量ROS，因此牛支原體可能抑制中性粒細(xì)胞的活性，同時(shí)抑制呼吸暴發(fā)的產(chǎn)生，從而降低宿主的免疫反應(yīng)。Wiggins M C等［36］也證實(shí)牛支原體可以抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS。

總之，在感染后期，牛支原體可能通過(guò)IL-10等抗炎細(xì)胞因子的釋放、分泌免疫抑制活性的多肽、抑制中性粒細(xì)胞等途徑，降低機(jī)體的免疫功能。在其他支原體如豬肺炎支原體的致病機(jī)制中未見(jiàn)關(guān)于降低機(jī)體免疫功能的相似報(bào)道［37］，此機(jī)制的存在不但為牛支原體在宿主內(nèi)長(zhǎng)期生存提供了條件，還可能是其與其他病原如多殺性巴氏桿菌多發(fā)混合感染的主要原因。

4　小結(jié)與展望

牛支原體的致病機(jī)制可能為病原體首先黏附于宿主呼吸道上皮細(xì)胞，隨后通過(guò)釋放局部代謝產(chǎn)物、毒素等直接損害宿主防御系統(tǒng)，或誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡；且可進(jìn)一步激活宿主炎癥細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，損傷宿主；在感染后期，通過(guò)抑制機(jī)體的免疫功能，從而在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存在，或者引起繼發(fā)感染。在牛支原體致病過(guò)程中，各致病因素的分泌水平、調(diào)控機(jī)制及對(duì)機(jī)體的影響可能隨感染時(shí)間不同和病情發(fā)展變化而有一定差異。因此，進(jìn)一步研究牛支原體各致病因素如黏附蛋白、細(xì)胞因子及ROS的分泌水平及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、闡明牛支原體脂蛋白或其他分泌物如何結(jié)合TLRs，激活包括NF-κB在內(nèi)的各種信號(hào)通路，產(chǎn)生不同細(xì)胞因子繼而觸發(fā)的促炎和抗炎作用及調(diào)控機(jī)制，將為從預(yù)防和控制牛支原體引發(fā)的疾病奠定理論基礎(chǔ)。

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Progress on Pathogenic Mechanism of Mycoplasma bovis

GAO Duo1，KONG Ling-cong1，JIA Bo-yan1，WANG Zi1，XU Feng-yu1，LIU Shu-ming1，MA Hong-xia1，2
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin，130118，China；2.Animal Production &Product Quality and Security，Ministry of Education，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin，130118，China）

Abstract：In recent years，Mycoplasma bovis has become one of the main pathogens causing bovine respiratory disease，poses a huge economic losses to cattle industry.This article reviewed the recent progress on pathogenic mechanism of Mycoplasma bovis in the domestic and overseas in order to provide a reference for prevention and control pneumonia disease caused by Mycoplasma bovis.Research on pathogenic mechanism of Mycoplasma bovis will provide theoretical basis for development of effective vaccine and new type of green drugs and other approaches of prevention and control，and then could effectively control the disease induced by Mycoplasma bovis in the clinic.This article summarized from following three aspects. Firstly，the role of Mycoplasma bovis adhesion protein on adhesion；Secondly，the injury to host cells by metabolites and the apoptosis mediated by related proteins；Thirdly，immunological pathogenic mechanisms including immunogenicity and immune evasion of adhesion protein，the immune response and inflammatory lesions of the host，the anti-inflammatory response and immunosuppression of the host.

Key words：Mycoplasma bovis；pathogenic mechanism；immunology

作者簡(jiǎn)介：高 鐸（1989-），男，吉林樺甸人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物藥理與毒理學(xué)研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272611）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才項(xiàng)目（NCET-10-0174）；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項(xiàng)目（2011-Y05）；吉林省牧業(yè)管理局項(xiàng)目（20120113）

收稿日期：2014-12-05

中圖分類號(hào)：S852.62

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）07-0090-05