貓杯狀病毒及疾病診療研究進展

孫雅鑫，吳 斌

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070）

貓杯狀病毒（Feline calicivirus，F(xiàn)CV）是貓的一種重要病原，在貓群中感染率很高，常單獨感染或與其他病原混合感染引起貓的上呼吸道癥狀和口腔潰瘍，也能引起貓的跛行、流產(chǎn)、慢性胃腸炎等其他疾病，嚴(yán)重威脅貓的健康。FCV 呈世界性分布，不僅感染貓，也可以感染所有貓科動物，如虎、獅子、豹等，對這些野生動物的健康也造成了一定威脅［1］。近年來在美國、英國和意大利等國家還相繼暴發(fā)了由FCV 引起的惡性系統(tǒng)性疾?。╲irulent systemic disease，VSD），感染貓出現(xiàn)高熱、食欲不振、萎靡、水腫、血凝異常等癥狀，有較高死亡率，且當(dāng)前疫苗對VSD 沒有保護性［2］。此外，F(xiàn)CV 是杯狀病毒科中少數(shù)能引起細胞病變的病毒，是諾如病毒（Norovirus，NoV）的重要替代模型［3］。本文將對貓杯狀病毒及其所引起疾病的診療方法做一綜述。

1 貓杯狀病毒概述

1.1 貓杯狀病毒基因組結(jié)構(gòu)

貓杯狀病毒（FCV）為無囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為7.7kb，5′端無帽子結(jié)構(gòu)，且與一病毒蛋白VPg 共價結(jié)合，3′端有polyA 尾結(jié)構(gòu)。基因組編碼3 個開放閱讀框（ORFs）。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括2C解旋酶、3C半胱氨酸蛋白酶以及3D RNA 依賴的RNA 聚合酶；ORF2 編碼主要衣殼蛋白前體，即VP1的前體；ORF3編碼一個小的結(jié)構(gòu)蛋白，即VP2。此外，F(xiàn)CV 還有一些長度不等的亞基因組RNA。在相當(dāng)長一段時間內(nèi)FCV都被認為只有1種基因型，很多學(xué)者嘗試從基因水平上對FCV 進行分型都失敗了，后來有報道稱在日本發(fā)現(xiàn)了第2種基因型［4］，從而使從基因水平上對FCV 進行分型成為可能。

1.2 FCV 蛋白與功能

在成熟的杯狀病毒中，主要存在4種結(jié)構(gòu)蛋白，即VP1、VP2、VPg 和前導(dǎo)衣殼蛋白（leader of the capsid，LC）。VP1是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒粒子的形成、抗原決定以及病毒－宿主細胞的相互作用中有關(guān)鍵作用；VP2 被認為是次要的結(jié)構(gòu)蛋白，在FCV 感染性克隆中引入終止密碼子終止VP2的表達后，并不影響VP1的自我組裝成病毒樣顆粒，但是缺少了完整的VP2蛋白后就無法形成具有感染力的病毒粒子；VPg蛋白與病毒基因組和亞基因組共價連接，在病毒粒子的結(jié)構(gòu)中起次要作用，其中VPg蛋白24位的酪氨酸在與RNA 形成共價鍵時起重要作用，突變會導(dǎo)致FCV 失活；LC是衣殼蛋白前體被酶切割后的產(chǎn)物，對病毒產(chǎn)生典型細胞病變有影響［5］。VP1擁有大部分中和抗體表位，是重點研究對象。衣殼蛋白可進一步分為A～F 六個區(qū)，B、D、F區(qū)在所有分離株中相對保守，而C、E 區(qū)則相對變異性較大。其中E 區(qū)大約427－524aa，又進一步被28個保守堿基（conE）分成5′端（33aa）和3′端（34aa）兩個高變區(qū)（HRV），可能是conE 決定了FCV 只有一種血清型［6］。

1.3 FCV 與宿主細胞間的相互作用

在FCV 生命周期中，某些宿主細胞因子起重要作用，影響FCV 進入宿主細胞復(fù)制、擴散等過程，如多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白（PTB）、核仁素、annexin A2［7］、組織蛋白酶L 及酸化的核內(nèi)體［8］等。貓組織細胞中的連接黏附分子A（junctional adhesion molecule A，JAM－A）是FCV 的一個受體，有助于FCV侵染宿主細胞。JAM－A 在貓全身組織細胞中廣泛存在，主要位于上皮細胞和內(nèi)皮細胞的細胞連接處，在貓的血小板中也有高表達，在貓血中的白細胞中表達量相對較低，當(dāng)FCV 感染貓單層上皮細胞時可使JAM－A 在感染細胞的胞質(zhì)中重新分布。自然感染FCV 引起口腔疾病時，可以從口腔上皮細胞中檢測到FCV；在引起系統(tǒng)疾病時，可以在多種類型的細胞中檢測到FCV，由此可以推測FCV 引起的病變范圍可以反映依賴JAM－A 功能的細胞連接分布情況以及細胞間緊密連接的完整性［9］。

1.4 FCV 疾病臨床癥狀

貓感染FCV 后出現(xiàn)的典型臨床癥狀有上呼吸道癥狀及結(jié)膜炎等，多數(shù)可自愈。強毒株可導(dǎo)致貓發(fā)熱、精神不振、口腔潰瘍、肺炎等癥狀，嚴(yán)重時死亡。FCV 也可引起多種非典型癥狀，如慢性胃腸炎、跛行、流產(chǎn)及尿道感染等。近年來在多國流行的FCV 強毒株（VS－FCV）可導(dǎo)致貓出現(xiàn)致命的系統(tǒng)性疾病，貓感染VS－FCV 后除了可能表現(xiàn)典型臨床癥狀外，也可能出現(xiàn)黃疸、皮膚潰瘍、嚴(yán)重水腫，甚至類似兔出血癥病毒（RHDV）臨床癥狀［10］。VS－FCV造成很高的發(fā)病率和死亡率，已免疫的成年貓也不能幸免。

1.5 FCV 流行病學(xué)

1957年，F(xiàn)astier L B［11］從患有上呼吸道癥狀的貓體內(nèi)首次分離獲得FCV，后來人們又從世界上很多國家和地區(qū)的貓及獵豹等中分離得到該病毒。1992年Kadoi等從患有潰瘍的非洲獅和東北虎的舌和鼻中分離得到貓杯狀病毒樣的病毒；1997 年王祥生、夏咸柱等首次從我國發(fā)病虎體內(nèi)分離到杯狀病毒；2002 年高玉偉等從上海某動物園患口腔潰瘍的獵豹和虎的唾液病料中分離得到兩株杯狀病毒。這表明貓杯狀病毒不僅在貓群中廣泛存在，也存在于獵豹、獅子和老虎等貓科動物種群中。此外，在狗體內(nèi)分離得到FCV［12］，但FCV 在狗與貓之間的傳播機率較低，F(xiàn)CV 是否在犬中流行還有待進一步研究。FCV 可感染各年齡段的貓，幼貓更易感，發(fā)病率高，死亡率低。感染FCV 后，貓常處于帶毒狀態(tài)，很多貓無任何癥狀，仍持續(xù)排毒多年，成為重要傳染源，唾液和眼鼻分泌物是FCV 主要載體。近年來，美國、英國、德國等多個國家相繼出現(xiàn)FCV 強毒株（VS－FCV）流行，病死率高。

2 FCV 疾病診療

2.1 FCV 疾病診斷方法

FCV 與貓皰疹病毒（Feline herpesvirus type 1，F(xiàn)HV－1）、貓細小病毒（Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV）等感染引起的癥狀非常相似，也可引起很多復(fù)雜的非典型癥狀，單從臨床癥狀難以診斷疾病。此外，雖然FCV 目前認為只有一種血清型，但極易發(fā)生抗原變異，這為臨床上檢測FCV 造成了極大困難。目前對FCV 感染的診斷主要依靠實驗室方法，如病毒分離、核酸檢測和血清學(xué)檢測等。

2.1.1 FCV 檢測 FCV 可在FK81、CRFK 等貓的傳代細胞上進行培養(yǎng)，是杯狀病毒科成員中極少數(shù)能在體外培養(yǎng)并產(chǎn)生細胞病變的病毒之一，故可以利用病毒分離方法進行檢測。將處理后的病料（如眼拭子、鼻拭子、口腔拭子等）接種于細胞后，若存在FCV，一般在48h后即可產(chǎn)生病變，病變的細胞會變圓、核固縮，聚縮成葡萄狀脫落，盲傳3代～5 代仍無病變的樣品可視為陰性。許多學(xué)者利用病毒分離這一方法從貓以及很多其他貓科動物體內(nèi)分離鑒定出FCV，如黃倩倩等從南京某寵物醫(yī)院一只家貓的鼻咽拭子中分離得到一株FCV，并將其命名為FB－NJ－13［13］。病毒分離是較為常用的檢測方法，其優(yōu)點是結(jié)果直觀，可增殖病毒，假陰性機率低，但也存在缺點，如耗時，一般觀察到明顯的病變需要數(shù)天，且出現(xiàn)細胞病變后，還需通過PCR 等方法進一步鑒定。

因FCV 具典型杯狀結(jié)構(gòu)，可通過電子顯微鏡技術(shù)對處理后的臨床病料或細胞培養(yǎng)物進行觀察鑒定是否有FCV 感染，但也有少數(shù)情況可能為NoV［14］。電鏡技術(shù)能較為準(zhǔn)確觀察病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但不能鑒別FCV 的不同毒株，且電鏡技術(shù)比較復(fù)雜，需要的儀器昂貴，檢測周期較長，不適于大量樣本的檢測。此外，EM 檢測的樣本中必須要有一定量的病毒，如果直接檢測病料，則需要病毒含量較高，故EM 不作為常規(guī)檢測手段。

2.1.2 FCV 核酸檢測 RT－PCR 是常用的RNA病毒核酸檢測方法，廣泛應(yīng)用于各種病毒的檢測，包括FCV。Ohe K 等［15］針對ORF2基因序列設(shè)計引物建立了RT－PCR 方法，并用該方法檢測到已免疫貓體內(nèi)存在FCV，同時發(fā)現(xiàn)免疫了Ⅰ型疫苗株的貓，可以檢測出Ⅱ型FCV 毒株，提議應(yīng)改進疫苗，提升疫苗效力。王翀等［16］針對FCV 的ORF2基因序列、FPV 的NS基因序列及FHV－1的TK 基因序列設(shè)計合成3 對引物，建立了能同時鑒別FCV、FPV和FHV－1的多重PCR 方法，對FCV 的最低檢出限可以達到101.9TCID50，用此方法對黑龍江省各地區(qū)收集的120 份貓血清，陽性率為2.5%（3／120）。Marsilio F等［17］建立了套式RT－PCR方法用于診斷FCV，用該方法檢測47只出現(xiàn)呼吸道癥狀的貓87份樣品（包括47份眼拭子和40份口腔拭子），結(jié)果顯示，18份眼拭子和23 份口腔拭子為陽性。用普通RT－PCR 和病毒分離方法對同一批樣品進行檢測，PT－PCR檢測結(jié)果，5份眼拭子和12份口腔拭子為陽性，而病毒分離結(jié)果則是5份眼拭子和13份口腔拭子為陽性，比較之下，套式RT－PCR 方法敏感性更高，但套式RT－PCR耗時相對增加。

姜雪等［18］利用TaqMan探針建立了快速檢測FCV 的熒光定量PCR 方法，特異性、敏感性和重復(fù)性實驗結(jié)果均良好，且用該方法對臨床24 份疑似FCV 感染貓的唾液樣品進行檢測，結(jié)果3份樣品為陽性，病毒分離和RT－PCR 方法復(fù)檢陽性樣品結(jié)果相同。Schulz C 等［19］成功利用熒光定量PCR 鑒別診斷FHV－1、FCV 和貓衣原體造成的貓上呼吸道癥狀，并用該方法分析了采樣部位對病原檢出率的影響，結(jié)果顯示從結(jié)膜、鼻腔及口腔等多個地方采樣可提高檢出率。幾種核酸檢測方法各有優(yōu)劣。常規(guī)RT－PCR 和套式RT－PCR敏感性高，樣品使用量少，且可以同時檢測多份樣品，更適用于普查初篩；熒光定量PCR 所用試劑相對昂貴，需熒光定量PCR 儀，但可省卻凝膠電泳過程，實現(xiàn)實時監(jiān)控、定量檢測。

2.1.3 FCV 血清學(xué)檢測 Digangi B A 等［20］利用中和抗體試驗檢測了弗羅里達動物收容所中347只貓血清中的FCV 和FHV－1抗體，用血凝抑制試驗檢測這些貓血清中的FPV 抗體，發(fā)現(xiàn)大部分貓3種病毒血清抗體都為陽性，其中抗FCV 抗體滴度在≥32的貓有127只，占總數(shù)的36.6%。中和抗體試驗不僅可以定性，也可以定量，敏感性和特異性都較高，但耗時長，一般需觀察數(shù)天。Yuan B等［21］制備了抗FCV 的單克隆抗體，并建立了夾心ELISA 方法用 于 檢 測FCV 抗 原。Diganqi B A 等［22］利 用ELISA 方法檢測貓群中FPV、FHV－1和FCV 的保護抗體滴度，發(fā)現(xiàn)該方法對FHV－1和FCV 的敏感性比較好，但對FPV 的敏感性相對較差。ELISA方法操作簡便，可量化指標(biāo)，適用于篩選大量樣本，缺點是影響結(jié)果的因素較多，如包被抗原純度、二抗稀釋度等。蔣紅等［23］制備兔抗貓IgG，建立了免疫酶染色法（IEA）和免疫熒光（IFA）兩種血清學(xué)方法，用兩種方法檢測5份貓血清樣品，發(fā)現(xiàn)IFA 的陽性檢出率略低于IEA。免疫染色技術(shù)同樣存在影響因素多，可能出現(xiàn)非特異性染色等問題，但檢測結(jié)果肉眼可見，較為直觀。

2.2 FCV 疾病防治方法

目前還沒有治療FCV 相關(guān)疾病的特異性藥物，主要是對癥治療和支持治療。有學(xué)者對德國某款商業(yè)化的FCV、FHV－1和FPV 三聯(lián)高免血清效果進行了評價，發(fā)現(xiàn)有上呼吸道癥狀的貓接種該高免血清后，早期癥狀有所改善，但隨后效果下降，且該高免血清不能減少感染貓的排毒量［24］。多種可能對FCV 有治療效果的藥物正在研發(fā)當(dāng)中，如乳酸菌［25］、甲氟喹［26］及貓ω－干擾素等。貓ω－干擾素對改善臨床癥狀效果不明顯，但是可能可以減少FCV在貓體內(nèi)的復(fù)制［27］。此外，也有學(xué)者研究用RNA干擾技術(shù)抑制FCV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)設(shè)計合成的特定小干擾RNA（siRNA）抑制FCV 病毒復(fù)制效果明顯，可以顯著降低病毒滴度［28］。

FCV 疾病主要依靠疫苗免疫預(yù)防。目前市場上使用最多的疫苗是加免疫佐劑的滅活或弱毒苗，需定期皮下或肌肉注射。也有多種其他類型的疫苗在某些國家上市使用，如美國的鼻內(nèi)免疫活疫苗和歐洲的無佐劑滅活疫苗。疫苗株應(yīng)與多種毒株有較強血清學(xué)交叉反應(yīng)才能產(chǎn)生良好保護力，故對疫苗株的選擇十分重要。包括我國在內(nèi)，目前世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣的仍是單價苗，常用疫苗株為F9 或FCV－255。但FCV 單價苗不能與所有毒株產(chǎn)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，尤其是VS－FCV，有學(xué)者提議可選擇合適的VS－FCV 作為疫苗株，可以對包括VS－FCV在內(nèi)的更多毒株產(chǎn)生交叉保護［29］。近年來一種新型二價疫苗在歐洲投入使用，該疫苗是由FCV－431和FCV－G1制成［30］。FCV 疫苗不僅在寵物行業(yè)應(yīng)用廣泛，在貓科野生動物的保護中也起重要作用。目前在老虎中使用多為FCV 單價苗，但Harrison T M 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，9只免疫了二價滅活苗的老虎血清與VS－FCV 毒株FCV－DD1 的 中 和 滴 度 更 高，提出二價疫苗可能可以給老虎提供更好的保護力，包括降低患VSD 的風(fēng)險。

3 展望

寵物行業(yè)發(fā)展迅速，很多人養(yǎng)貓作為寵物，貓病也日益受重視。FCV 除感染貓外，也可感染其他貓科動物，如國家一級保護動物東北虎等，對這類野生動物的健康構(gòu)成一定威脅。此外，諾如病毒急需利用FCV 等替代模型研究其相關(guān)特性，故加快FCV的研究進度十分必要。不僅應(yīng)從FCV 的分子生物學(xué)方面著手研究，也應(yīng)加快對FCV 檢測方法、特異性藥物以及新型疫苗的研制。在檢測方面，應(yīng)研制更適用于臨床檢測的方法，在改進現(xiàn)有的檢測方法的同時，也可利用新技術(shù)，如膠體金試紙條技術(shù)等，滿足快速、方便、靈敏、價格低廉等實際臨床檢測的要求；在治療方面，可以借鑒其他病毒的特異性藥物研究進展，如利用單抗技術(shù)；在預(yù)防方面，欲改進疫苗，解決疫苗免疫失敗問題，增加免疫成功幾率，可從多方面考慮，如選用新疫苗株、制備多價苗及基因工程疫苗等。相信在不久的將來，會建立更優(yōu)化的檢測方法，研制出特異性藥物以及新型疫苗，從而更好地防控FCV 相關(guān)疾病。

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