結(jié)核分支桿菌復(fù)合群DNA 分型研究進(jìn)展

程廣宇，劉春法，崔永勇，周 洋，趙德明，周向梅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193）

結(jié)核?。═uberculosis，TB）是人類最古老的疫病之一，至今已感染無數(shù)的人群并且仍對(duì)易感人群造成巨大的威脅。2014年世界衛(wèi)生組織（WHO）的結(jié)核病報(bào)告，2013 年新感染人數(shù)約為900 萬，造成的死亡人數(shù)約為150萬［1］。人類對(duì)結(jié)核病的起源和傳染特性在很長(zhǎng)一段時(shí)間里無從知曉，直到19世紀(jì)末Koch R［2］證實(shí)其是一種細(xì)菌性疾病。結(jié)核病主要是由結(jié)核分支桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）中的細(xì)菌引起的，是一種在全球范圍內(nèi)具有重要影響的人獸共患病，由于這類細(xì)菌對(duì)人和動(dòng)物具有潛在感染的威脅，人們對(duì)其研究也越來越廣泛和深入。

自1882年首次分離出結(jié)核分支桿菌病原體以來，人們已經(jīng)獲得了大量MTBC 細(xì)菌的特性、毒力及其致病性的知識(shí)，并從MTBC 引起宿主的免疫反應(yīng)以及免疫逃逸機(jī)制進(jìn)行了大量研究。但是，人們能夠得以深入闡明結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的起源和菌群結(jié)構(gòu)，還是得益于近年來的基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展。目前，有關(guān)結(jié)核病病原體的基因組數(shù)據(jù)越來越多，有關(guān)結(jié)核病公共健康的問題日益嚴(yán)重和突出，這就要求我們利用現(xiàn)有的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，加深對(duì)MTBC的起源和系統(tǒng)進(jìn)化的理解，為開發(fā)更有效疫苗并制定更好的防控計(jì)劃奠定基礎(chǔ)。本文對(duì)最新的MTBC 的基因組DNA 分型技術(shù)進(jìn)行總結(jié)并提出展望，以期對(duì)這類人類歷史上傳播最廣致死最多的細(xì)菌病原體進(jìn)行深入的分析和掌握，進(jìn)而為防控這類病原體提供依據(jù)。

1 結(jié)核分支桿菌復(fù)合群

根據(jù)MTBC 菌株的宿主傾向性和基因組多樣性不同，目前結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的成員主要包括以下菌種。

1.1 結(jié)核分支桿菌

結(jié)核分支桿菌（M.tuberculosis）是導(dǎo)致人類結(jié)核病的主要病原體，也是對(duì)人類影響最大的細(xì)菌性病原體之一。目前已有諸多M.tuberculosis 感染牛、山羊、家豬、貓、狗、鹿和動(dòng)物園中的野生動(dòng)物等的報(bào)道。在全球范圍內(nèi)，M.tuberculosis 被廣泛認(rèn)為是一種亟需關(guān)注的人畜共患病病原體。在很多國(guó)家，尤其在發(fā)展中國(guó)家飼養(yǎng)牛感染M.tuberculosis的診斷越來越多［3］。Ameni G 等［4］在2011年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)在埃塞俄比亞的放牧牛中M.tuberculosis的感染率約為27%。

1.2 牛分支桿菌

牛分支桿菌（M.bovis）是?？苿?dòng)物結(jié)核病中最常見的病原體，1898年首次分離出M.bovis菌株以來。雖然研究人員一直認(rèn)為它和M.tuberculosis存在表型差異，但直到1970年才被認(rèn)定為新的菌種。M.bovis宿主范圍廣泛，目前已有感染北美野牛、羚羊、山羊、家豬、野豬、馬、貓、夠等諸多動(dòng)物的報(bào)道。目前在結(jié)核病人的診斷中，已出現(xiàn)多例M.bovis和M.tuberculosis混合感染的病例。但臨床醫(yī)生通常不會(huì)考慮到這點(diǎn)，因?yàn)橛蒑.bovis和M.tuberculosis引起的疾病在臨床診斷，射線照相檢測(cè)以及組織病理學(xué)檢查都是無法分辨的［5］。M.bovis對(duì)國(guó)家間經(jīng)濟(jì)貿(mào)易和人類公共衛(wèi)生是不容忽視的潛在威脅。

1.3 坎納分支桿菌

坎納分支桿菌（M.canettii）是一種較為古老的結(jié)核分支桿菌復(fù)合群祖先菌株，與MTBC中的其他菌種差異較大是因?yàn)榛蚪M中有很強(qiáng)的水平基因轉(zhuǎn)移，特征是菌落培養(yǎng)快速且菌落形態(tài)光滑有光澤。法國(guó)微生物學(xué)家Georges Canetti最早于1969年分離出該菌種并進(jìn)行研究。雖然偶有M.canettii感染人類的報(bào)道出現(xiàn)，但未有人與之間傳播的報(bào)道。目前M.canettii在自然界中的生存模式和宿主范圍仍是未知的。Blouin Y 等［6］對(duì)吉布提臨床病人分離株進(jìn)行的研究表明，對(duì)該病原體及它的自然宿主范圍的更多認(rèn)識(shí)對(duì)于臨床診斷是非常重要的。

1.4 非洲分支桿菌

1968年在塞內(nèi)加爾首次發(fā)現(xiàn)的非洲型結(jié)核分支桿菌（M.africanum），主要流行于非洲西部，是感染非洲西部近一半結(jié)核病人的病原菌。M.africanum 的傳播性和致病性要弱于M.tuberculosis［7］。在非洲以外地區(qū)，偶有人類感染該病原體的報(bào)道。雖然在猴子和奶牛中都曾分離出M.africanum 菌株，但由于發(fā)生率低且難以鑒定，M.africanum 在自然界中生存的宿主依然不清楚。

1.5 海豹分支桿菌

最早從海豹中分離出海豹分支桿菌（M.pinnipedii），它的自然界宿主是南半球的海洋哺乳動(dòng)物，近年來在全球各地區(qū)的海洋館中偶有M.pinnipedii感染海狗、海豚等海洋動(dòng)物的事件。而海豹馴獸師確認(rèn)感染M.pinnipedii的報(bào)道表明了M.pinnipedii菌株人獸共患的潛在威脅［8］。最新的研究表明M.pinnipedii可以感染在海岸放牧的牛群，但無牛只間傳播的證據(jù)［9］。

1.6 Caprae分支桿菌

Caprae分支桿菌（M.caprae）在過去一直被認(rèn)為是M.tuberculosis或M.bovis的亞群，而oxyR、pncA、katG、gyrA 和gyrβ基因的基因多樣性使它成為MTBC中的獨(dú)立菌種。在歐洲中西部的很多國(guó)家的家牛、家豬、野豬和駱駝等動(dòng)物中都曾分離出該菌株。歐盟委員會(huì)在2013 年已經(jīng)把M.caprae劃為牛結(jié)核病的病原之一。而人類感染M.caprae的報(bào)道使眾多研究者對(duì)它的重視日愈增加［10］。

1.7 田鼠分支桿菌

田鼠分支桿菌（M.microti）最早由田鼠中分離出來，也可感染貓、家豬、獾等哺乳動(dòng)物。20世紀(jì)50年代，在英國(guó)人們?cè)肕.microti當(dāng)做活疫苗來對(duì)牛群進(jìn)行免疫。而近期的報(bào)道表明，M.microti可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生有效免疫。在英國(guó)西南地區(qū)，M.microti在獾群中流行，這可能使獾群產(chǎn)生對(duì)M.bovis的有效免疫而使得M.bovis在獾群中極少發(fā)生，并且也可能是當(dāng)?shù)責(zé)oM.bovis感染牛群的關(guān)鍵因素。在近期歐洲山豬的結(jié)核病調(diào)查中，M.microti感染比例呈上升趨勢(shì)，可能使未來結(jié)核病的防控更加復(fù)雜［11］。

2 MTBC的DNA 指紋圖譜研究

MTBC中的菌株在16SrRNA 有一致的序列片段，在核苷酸水平約有99.9%的相似度，在很長(zhǎng)一段時(shí)期被認(rèn)為在自然界中是以單型菌株存在的［14］。后來發(fā)現(xiàn)的一些分子標(biāo)志物，可以用于區(qū)分MTBC菌株。目前已經(jīng)有一系列DNA 指紋圖譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于MTBC流行病學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化研究。

2.1 IS6110 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

IS6110 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分 析 是MTBC第一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)分型方法。IS6110RFLP 分析基于Southern 印跡雜交技術(shù)，根據(jù)基因組中IS6110插入序列插入位點(diǎn)可變性和插入數(shù)目不同進(jìn)行基因分型。優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)IS6110插入序列重復(fù)數(shù)目超過6個(gè)，分辨力很強(qiáng)，可通過鑒別臨床分離株是否具備一致的RFLP 型而應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查。缺點(diǎn)是由于無法推測(cè)插入事件的發(fā)生順序因而不適合應(yīng)用于系統(tǒng)進(jìn)化研究，另一方面需要用到大量的DNA 樣本，操作繁瑣費(fèi)時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果難以比較［15］。目前使用該技術(shù)的研究呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)，同時(shí)基于PCR 技術(shù)的研究方法逐漸發(fā)展，得到更廣泛的應(yīng)用。

2.2 Spoligotyping 分 型

Spoligotyping分型方法基于PCR 反向點(diǎn)核酸雜交技術(shù)，根據(jù)直接重復(fù)區(qū)（DR 區(qū)）多樣性對(duì)MTBC進(jìn)行基因分型。DR 區(qū)內(nèi)若干個(gè)長(zhǎng)度為36bp的直接重復(fù)序列被不同長(zhǎng)度的間隔區(qū)序列分隔，以選取的43個(gè)間隔區(qū)序列的存在或缺失記錄結(jié)果。間隔區(qū)發(fā)生缺失原因可能是同源重組或者IS6110插入序列轉(zhuǎn)座［16］。Spoligotyping分型優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果易于統(tǒng)計(jì)，便于實(shí)驗(yàn)室間交流比較，是目前廣泛應(yīng)用的MTBC基因分型方法。缺點(diǎn)是雖然間隔區(qū)缺失是不可逆事件，但是由于存在趨同進(jìn)化現(xiàn)象，并不適合系統(tǒng)進(jìn)化研究。Spoligotyping 分型與基因芯片、微球液相芯片等技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用使得數(shù)據(jù)處理可自動(dòng)化，檢測(cè)操作更加快速簡(jiǎn)便［17］。

2.3 多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析

多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multi－locus variable－number tandem repeat analysis，MLVA）是基于PCR 技術(shù)的基因分型方法。結(jié)核分支桿菌散在分布數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列分型方法（mycobacterial interspersed repetitive units－variable number tandem repeats，MIRU－VNTR）通常根據(jù)選取的12、15或24位點(diǎn)序列重復(fù)數(shù)目多樣性進(jìn)行基因分型［18］。12或15位點(diǎn)的MIRU－VNTR 分型適合應(yīng)用于流行病學(xué)研究，而24位點(diǎn)的MIRUVNTR 分型可用于MTBC 系統(tǒng)進(jìn)化研究。目前諸多研究表明，根據(jù)地理位置不同和流行株的區(qū)別，可以選用合適的位點(diǎn)組合達(dá)到最佳的基因組分型效果［19－20］。

2.4 長(zhǎng)序列多態(tài)性或區(qū)域缺失

由于MTBC菌株間幾乎沒有水平基因轉(zhuǎn)移，長(zhǎng)序列多態(tài)性（long sequence polymorphisms，LSP）或區(qū)域缺失（regions of deletions，RD）分析是MTBC系統(tǒng)進(jìn)化研究和菌株間多樣性研究的重要手段?；蚪M中一系列的插入或不可逆的缺失事件造成MTBC內(nèi)各菌種之間的差異。研究表明所有的祖先菌株保存有TbD1序列，而現(xiàn)代菌株均表現(xiàn)為缺失。Gagneux S 等［21］運(yùn)用比較基因組學(xué)的方法對(duì)MTBC內(nèi)的菌株進(jìn)行長(zhǎng)片段多態(tài)性分析，鑒別出全球的六大主要的菌系（Indo－Oceanic；East－Asian including Beijing；East－African－Indian；Euro－American；West Africa or Mycobacterium africanumⅠ；West Africa or M.africanum Ⅱ）。RD 分析可用于MTBC內(nèi)菌種的快速鑒定，例如RD9可將M.tuberculosis和M.canettii和MTBC 其他成員區(qū)分開，而RD4是M.bovis獨(dú)有的缺失［22］。

2.5 全基因組測(cè)序

1999年MTBC 中的M.tuberculosis全基因組測(cè) 序（whole－genome sequencing，WGS）完 成 以來［23］，隨著近5年DNA 測(cè)序技術(shù)的的快速發(fā)展，越來越多的MTBC臨床株完成全基因組測(cè)序。WGS分型外的各種基因分型方法均有一定程度的缺陷，此外，多個(gè)調(diào)查研究表明這些研究手段均無法準(zhǔn)確判斷感染傳播條鏈。因此，基于WGS 分析的基因分型方法無疑是MTBC 流行病學(xué)研究和系統(tǒng)進(jìn)化研究最可靠的選擇。目前多個(gè)研究小組運(yùn)用比較基因組學(xué)分析，已提出不同的單核苷酸突變（single nucleotide polymorphisms，SNPs）分型體系。如Coll F等［14］提出62個(gè)SNPs分析方法對(duì)MTBC的6大主系和M.bovis以及55個(gè)亞系進(jìn)行鑒別區(qū)分。Jamieson F B等［24］研究證明，全基因組分析的分辨力更高，準(zhǔn)確性更高，尤其適用于基因組近似度更高的結(jié)核分支桿菌菌系。此外，對(duì)于擁有相同DNA指紋圖譜的菌株，非同義氨基酸突變可能朝著有利于菌株的方向改變多肽鏈順序，進(jìn)而有助于理解抗藥性突變菌株的發(fā)生和傳播；而同義氨基酸突變不影響菌株功能性表達(dá)，可應(yīng)用于MTBC系統(tǒng)進(jìn)化研究，更好地理解菌株間的進(jìn)化關(guān)系。

3 展望

Spoligotyping和MIRU－VNTR 分型方法的結(jié)合應(yīng)用可大大提高基因分型的分辨力，適用于結(jié)核病分子流行病學(xué)調(diào)查研究［25－26］。目前已有多個(gè)基于全球不同地區(qū)Spoligotyping和MIRU－VNTR 分型基因分型數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)，例如SITVITWEB 和MIRU－VNTRplus。目前美國(guó)CDC 結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)每一例結(jié)核病臨床分離株進(jìn)行Spoligotyping和MIRU 分型檢測(cè)。

雖然結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的基因組相似度極高，但是在進(jìn)化過程中賦予了不同的宿主偏好、表型和致病性。近年來，尤其是比較基因組學(xué)理論和基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和普及應(yīng)用，基于全基因組測(cè)序的結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的數(shù)據(jù)日益增多。使用基因組比較工具等手段可以得到更可靠的全球MTBC基因組多樣性分析結(jié)果，更好地應(yīng)用于結(jié)核病分子流行病學(xué)調(diào)查研究和系統(tǒng)進(jìn)化研究。還可以進(jìn)一步研究基因組多樣性對(duì)基因功能和宿主免疫識(shí)別等的影響，理解細(xì)菌病原體的毒力作用與宿主之間的互作關(guān)系，從而有助于了解結(jié)核病的發(fā)病機(jī)理并制定合理的防控措施。

Theobald Smith 1896年成功區(qū)分牛結(jié)核病和人類結(jié)核病的主要病原體分別是M.bovis和M.tuberculosis以來，結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的成員不斷壯大。但100多年以來，除了在結(jié)核病的預(yù)防治療方面的具體研究和比較研究已取得一些進(jìn)展，目前關(guān)于MTBC的進(jìn)化途徑、基因組差異和宿主傾向性等研究仍有很多疑問尚待解決，MTBC 的進(jìn)一步研究依然有著巨大潛力。

［1］ WHO.Global tuberculosis report［R］.2014.

［2］ Koch R.Die aetiogie der tuberculose［J］.Berl Klin Wochenschr，1882，19：221－230.

［3］ Mittal M，Chakravarti S，Sharma V，et al.Evidence of presence of Mycobacterium tuberculosis in bovine tissue samples by multiplex PCR：possible relevance to reverse zoonosis［J］.Transb Emerg Dis，2014，61（2）：97－104.

［4］ Ameni G，Vordermeier M，F(xiàn)irdessa R，et al.Mycobacterium tuberculosis infection in grazing cattle in central Ethiopia［J］.Vet J，2011，188（3）：359－361.

［5］ Perez－Lago L，Navarro Y，Garcia－de－Viedm D.Current knowledge and pending challenges in zoonosis caused by Mycobacterium bovis：A review［J］.Res Vet Sci，2014，97：S94－S100.

［6］ Blouin Y，Cazajous G，Dehan C，et al.Progenitor“Mycobacterium canettii”clone responsible for lymph node tuberculosis epidemic，Djibouti［J］.Emerg Infect Dis，2014，20（1）：21－28.

［7］ Doughty E L，Sergeant M J，Adetifa I，et al.Culture－independent detection and characterisation of Mycobacterium tuberculosis and M.africanumin sputum samples using shotgun metagenomics on a benchtop sequencer［J］.Peer J，2014，2：e585.

［8］ Kiers A，Klarenbeek A，Mendelts B，et al.Transmission of Mycobacterium pinnipedii to humans in a zoo with marine mammals［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2008，12（12）：1469－1473.

［9］ Loeffler S H，de Lisle G W，Neill M A，et al.The seal tuberculosis agent，Mycobacterium pinnipedii，infects domestic cattle in New Zealand：epidemiologic factors and DNA strain typing［J］.J Wildlife Dis，2014，50（2）：180－187.

［10］ Lahlou O，Millet J，Chaoui I，et al.The genotypic population structure of Mycobacterium tuberculosis complex from moroccan patients reveals a predominance of Euro－American lineages［J］.PLoS One，2012，7（10）：e47113.

［11］ Chiari M，F(xiàn)errari N，Giardiello D，et al.Spatiotemporal and ecological patterns of Mycobacterium microti infection in wild boar（Sus scrofa）［J］.Transb Emerg Dis，2015.

［12］ Karpathy S E，Dasch G A，Eremeeva M E.Molecular typing of isolates of Rickettsia rickettsii by use of DNA sequencing of variable intergenic regions［J］.J Clin Microbiol，2007，45（8）：2545－2553.

［13］ Liang J，Teng X，Yuan X，et al.Enhanced and durable protective immune responses induced by a cocktail of recombinant BCG strains expressing antigens of multistage of Mycobacterium tuberculosis［J］.Mol Immunol，2015，66（2）：392－401.

［14］ Coll F，McNerney R，Guerra－Assuncao J A，et al.A robust SNP barcode for typing Mycobacterium tuberculosis complex strains［J］.Nat Commun，2014，5：4812－4816.

［15］ Nghiem M N，Nguyen B V，Nguyen S T，et al.A Simple，single triplex PCR of IS6110，IS1081，and 23Sribosomal DNA targets，developed for rapid detection and discrimination of Mycobacterium from clinical samples［J］.J Microbiol Biotechnol，2015，25（5）：745－752.

［16］ Garbaccio S，Macias A，Shimizu E，et al.Association between spoligotype－VNTR types and virulence of Mycobacterium bovis in cattle［J］.Virulence，2014，5（2）：297－302.

［17］ Ruettger A，Nieter J，Skrypnyk A，et al.Rapid spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria by use of a microarray system with automatic data processing and assignment［J］.J Clin Microbiol，2012，50（7）：2492－2495.

［18］ Je S，Ku B K，Jeon B Y，et al.Extent of Mycobacterium bovis transmission among animals of dairy and beef cattle and deer farms in South Korea determined by variable－number tandem repeats typing［J］.Vet Microbiol，2015，176（3－4）：274－281.

［19］ Bolado－Martinez E，Benavides－Davila I，Candia－Plata Mdel C，et al.Proposal of a screening MIRU－VNTR panel for the preliminary genotyping of Mycobacterium bovis in Mexico［J］.Bio Med Res Int，2015，2015：416479.

［20］ Yang L，Wang C，Wang H，et al.Evaluation of MIRU－VNTR for typing of Mycobacterium bovis isolated from Sika deer in Northeast China［J］.BMC Vet Res，2015，11（1）：93－99.

［21］ Gagneux S，DeRiemer K，Van T，et al.Variable host－pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis［J］.Proceed Nat Acad Sci USA，2006，103（8）：2869－2873.

［22］ Huard R C，F(xiàn)abre M，de Haas P，et al.Novel genetic polymorphisms that further delineate the phylogeny of the Mycobacterium tuberculosis complex［J］.J Bacteriol，2006，188（12）：4271－4287.

［23］ Cole S T，Brosch R，Parkhill J，et al.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence［J］.Nature，1998，393（6685）：537－544.

［24］ Jamieson F B，Teatero S，Guthrie J L，et al.Whole－genome sequencing of the Mycobacterium tuberculosis Manila sublineage results in less clustering and better resolution than mycobacterial interspersed repetitive－unit－variable－number tandem－repeat（MIRU－VNTR）typing and spoligotyping［J］.J Clin Microbiol，2014，52（10）：3795－3798.

［25］ Chaoui I，Zozio T，Lahlou O，et al.Contribution of spoligotyping and MIRU－VNTRs to characterize prevalent Mycobacterium tuberculosis genotypes infecting tuberculosis patients in Morocco［J］.Inf Gen Evol，2014，21：463－471.

［26］ Streit E，Baboolal S，Akpaka P E，et al.Finer characterization of Mycobacterium tuberculosis using spoligotyping and 15－loci MIRU－VNTRs reveals phylogeographical specificities of isolates circulating in Guyana and Suriname［J］.Inf Gen Evol，2015，30：114－119.