布魯菌病細(xì)胞免疫診斷靶點(diǎn)抗原研究進(jìn)展

杜 強(qiáng)，徐正中，陳 祥，焦新安

（揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009）

布魯菌病（Brucellosis）（布?。┦怯刹剪斁鸬囊活惵詡魅静?。布魯菌可感染人和多種動(dòng)物，且各生物種的毒力和致病力各不相同，沙林鼠布魯菌、綿羊布魯菌、犬布魯菌、牛布魯菌等分別主要感染嚙齒動(dòng)物、綿羊、犬、牛等；而人感染的布魯菌菌型以羊型最多見，牛型最少。感染布病會累及多個(gè)器官的功能衰退，嚴(yán)重者喪失勞動(dòng)和生活能力。由于布病自身特點(diǎn)和疫苗的使用，使布病的診斷中容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)和假陽性?，F(xiàn)階段，布病的實(shí)驗(yàn)室診斷手段主要有：①細(xì)菌學(xué)方法。通過培養(yǎng)病原體，根據(jù)其生物學(xué)特征進(jìn)行判斷。細(xì)菌學(xué)診斷方法是布病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，診斷的可靠性和準(zhǔn)確性最高［1］。②分子生物學(xué)技術(shù)。Baily G G 等［2］建立了布魯菌屬細(xì)菌特異性的PCR 檢測方法，Bricker B J等［3］針對布魯菌的插入序列IS711建立了AMOS－PCR 方法；丁家波等［4］建立的布魯菌屬鑒定多重PCR 方法可對不同種的布魯菌進(jìn)行快速、敏感、準(zhǔn)確地鑒別。③血清學(xué)方法。包括試管凝集試驗(yàn)（SAT）、虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。RBPT 快速方便，適于大量篩選；SAT、CFT 的敏感性和特異性相對較高，是一些國家和機(jī)構(gòu)公認(rèn)的確診試驗(yàn)［5］。ELISA 是公認(rèn)的特異性和敏感性相對較高的布病診斷方法。

布魯菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，感染機(jī)體后主要引起細(xì)胞免疫為主，體液免疫為輔的免疫應(yīng)答。而細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可以產(chǎn)生較多的細(xì)胞因子，在機(jī)體對抗感染的過程中發(fā)揮重要的作用。對于不同細(xì)胞因子的檢測，一方面反映機(jī)體的免疫水平和感染狀況，另一方面在機(jī)體感染布魯菌的初期就能特異性地檢測到較高水平的細(xì)胞因子釋放，這為布病的及時(shí)診斷提供了手段。現(xiàn)階段細(xì)胞免疫學(xué)診斷方法的研究多為尋找合適的免疫原性蛋白［6］，這些蛋白可以激活T 細(xì)胞反應(yīng)，包括活化巨噬細(xì)胞和CD4＋、CD8＋T 細(xì)胞，產(chǎn)生幾種重要的細(xì)胞因子，如IFN－γ、TNF－α等。這些細(xì)胞因子在清除機(jī)體內(nèi)布魯菌的過程中起著重要的作用。特別是IFN－γ的分泌是宿主產(chǎn)生T 細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)，其在對抗布魯菌感染中起著重要作用，檢測IFN－γ分泌狀況可間接反映微生物感染機(jī)體后不同蛋白在體內(nèi)刺激產(chǎn)生細(xì)胞免疫的狀況。鑒于針對細(xì)胞因子的檢測在結(jié)核病診斷中的成功應(yīng)用，抗原特異性的IFN－γ檢測可以成為牛、羊等動(dòng)物布病診斷的潛在手段之一［7］。Tittarelli M 等［8］使用RB51株分離純化的蛋白對RB51 疫苗免疫過的奶牛進(jìn)行全血體外刺激IFN－γ釋放試驗(yàn)，通過與CFT 結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，該方法具有良好的敏感性和特異性。Ferrer D M 等［9］使用多種抗原蛋白作為刺激原對Rev.1疫苗免疫過的羊血樣進(jìn)行刺激試驗(yàn)，可檢測到較高水平的IFN－γ釋放。目前布魯菌免疫原性蛋白的研究主要集中在外膜蛋白和菌體蛋白。

1 外膜蛋白

外膜蛋白（Omp）是原核生物細(xì)胞膜的重要組成成分，在維持細(xì)菌正常形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)菌在機(jī)體內(nèi)的生存和繁殖中發(fā)揮著重要作用。Omp 分子免疫學(xué)和基因組學(xué)的分析表明，其在疾病臨床診斷和疾病預(yù)防方面具有潛力。Omp具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生重要的細(xì)胞因子，因此成為重要的免疫診斷靶點(diǎn)。

1.1 BCSP31蛋白

BCSP31蛋白（布魯菌細(xì)胞膜蛋白31）分子質(zhì)量約為31ku，是重要的布魯菌Omp之一，在多種布魯菌間基因同源性達(dá)100%，該蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性和特異性。利用蛋白芯片進(jìn)行布魯菌蛋白免疫學(xué)檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，BCSP31 的抗體只存在于感染的山羊血清中，而在感染布魯菌的人血清中并未發(fā)現(xiàn)其抗體，預(yù)示該蛋白在檢測區(qū)分人群的布病感染和疫苗免疫中具有應(yīng)用前景?；贐CSP31基因建立的分子生物學(xué)檢測方法在布病特異性診斷上的應(yīng)用，BCSP31 蛋白有望成為布病血清學(xué)特異性診斷靶點(diǎn)［10］。

1.2 Omp10蛋白

Omp10蛋白（外膜蛋白10）屬于菌體外膜脂蛋白，大小約為10ku，是布魯菌重要的抗原蛋白，存在于所有的布魯菌中。Omp10是一類不完整的Omp，具有脂蛋白特性，保持較強(qiáng)的抗原性。更重要的是該蛋白與自然感染牛的血清不發(fā)生反應(yīng)，但可與自然感染羊的血清發(fā)生反應(yīng)，因此可以作為布病區(qū)別診斷的候選診斷靶點(diǎn)之一。陳瑤等［11］將Bp26 和Omp 10蛋白聯(lián)合應(yīng)用于布病的血清學(xué)檢測，提高了檢測的敏感性，并且能夠區(qū)分自然感染與疫苗接種。因此，以O(shè)mp10作為區(qū)別診斷抗原在臨床檢測中具有應(yīng)用前景。

1.3 Omp31蛋白

Omp31蛋白（外膜蛋白31）是粗糙型布魯菌最重要的保護(hù)性抗原蛋白之一，其基因存在于除牛種之外其他所有的布魯菌中，基因序列同源性高達(dá)98%以上。Omp31蛋白是一種優(yōu)勢的T 細(xì)胞免疫抗原，具有作為細(xì)胞免疫診斷靶點(diǎn)的潛力。Gupta V K 等［12］發(fā)現(xiàn)重組Omp31蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對Omp31蛋白的抗體，并且刺激T 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放大量的IFN－γ。Wang W 等［13］使用Bp26和Omp31的多肽鏈刺激羊種布魯菌疫苗免疫后的綿羊全血，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的多肽鏈可以引起免疫細(xì)胞分泌大量的IFN－γ，表明多肽（蛋白）刺激全血后IFN－γ的分泌與病原菌感染之間存在相關(guān)性。更重要的是，由于Omp31基因在牛種布魯菌中的缺失，使得Omp31抗原蛋白成為牛種布病區(qū)別診斷最重要的診斷靶點(diǎn)之一。

1.4 Bp26蛋白

Bp26蛋白（外膜蛋白26）是布魯菌的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，其DNA 序列具有高度的同源性。Bp26是由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外釋放的可溶性蛋白，是一種免疫優(yōu)勢抗原和重要的診斷抗原［14］，具有高敏感性、特異性和易于檢測的優(yōu)點(diǎn)。其在布魯菌侵染宿主時(shí)可引起宿主的細(xì)胞免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞增殖并且促使細(xì)胞因子表達(dá)量的增加。利用同源重組的方法，構(gòu)建Bp26疫苗突變株M5－90－26，可用來區(qū)分該疫苗株免疫與自然感染［15］，顯示其在布病診斷中的應(yīng)用前景。同時(shí)，Bp26蛋白在一些疫苗中的表達(dá)存在明顯的弱化甚至缺失的現(xiàn)象，表現(xiàn)其作為免疫診斷靶點(diǎn)的優(yōu)勢。通過原核表達(dá)的方式獲得可溶性Bp26 蛋白，并以此建立iELISA 方法，與進(jìn)口試劑盒比較發(fā)現(xiàn)該iELISA 的檢測符合率可以達(dá)到96.67%，顯示出該方法在布病臨床檢測中的應(yīng)用價(jià)值［16］。因此，接種缺失株疫苗（如Bp26的缺失株疫苗）免疫的個(gè)體，再使用以Bp26蛋白建立的iELISA方法將檢測不出陽性，這可以在布病的自然感染和疫苗免疫的區(qū)別診斷中發(fā)揮重要作用。

2 菌體蛋白

除Omp外，布魯菌中的其他蛋白，如伴侶蛋白GroES及GroEL，核糖體蛋白L7／L12，Cu－Zn超氧化物歧化酶等同樣具有免疫原性，它們也具有作為細(xì)胞免疫學(xué)診斷靶點(diǎn)抗原的潛力。

2.1 L7／L12蛋白

L7／L12蛋白（核糖體蛋白L7／L12）是布魯菌胞漿核蛋白，是核糖體的重要組成部分，其在不同的布魯菌中基因同源性高達(dá)97.1%以上。其是一種T細(xì)胞優(yōu)勢抗原，能特異性地刺激感染動(dòng)物的單核細(xì)胞，并上調(diào)IFN－γ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在機(jī)體對抗布魯菌入侵的過程中發(fā)揮重要作用［17］。以L7／L12為基礎(chǔ)制備的DNA 疫苗可以引起機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，如利用重組表達(dá)質(zhì)粒pCAGG－L7／L12進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn)后，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，使用ELISPOT 技術(shù)可測定小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌較高水平的IFN－γ。接種B.abortus S19疫苗免疫的牛，其全血在體外通過B.abortus L7／L12 蛋白的刺激，可以誘發(fā)CD4＋和CD8＋T 細(xì)胞增殖反應(yīng)，并釋放大量的IFN－γ［17］。表明病原菌感染牛以后，抗原蛋白體外刺激感染牛全血所產(chǎn)生的IFN－γ與疾病之間存在相關(guān)性，如果這種關(guān)系可以通過某種定量關(guān)系展現(xiàn)出來，這將成為布病細(xì)胞免疫診斷研究的重大突破。因此，L7／L12蛋白是免疫或感染的個(gè)體產(chǎn)生IFN－γ 的重要刺激原，具有成為細(xì)胞免疫診斷靶點(diǎn)的潛力。

2.2 GroEL蛋白

GroEL蛋白（伴侶蛋白GroEL）大小約為60 ku，廣泛存在于病原微生物中，在蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝、蛋白質(zhì)的變復(fù)性以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等過程中起重要作用，同時(shí)也是一種免疫優(yōu)勢抗原。在布魯菌感染機(jī)體以后，GroEL 能夠參與誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫［18］。GroEL 在進(jìn)化過程中具有較高的保守性，作為診斷靶點(diǎn)具有一定的特異性。S19疫苗株免疫小鼠后，提取的小鼠脾臟細(xì)胞在GroEL體外刺激下可產(chǎn)生IFN－γ。這預(yù)示著疫苗免疫后，GroEL可刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ，表明GroEL 是一種良好的刺激原，是細(xì)胞免疫診斷靶點(diǎn)抗原的候選蛋白之一。

2.3 Cu－Zn SOD蛋白

Cu－Zn SOD 蛋白（超氧化物歧化酶）只存在于布魯菌在內(nèi)的少數(shù)細(xì)菌中，屬于應(yīng)激蛋白，是細(xì)菌為了適應(yīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)惡劣環(huán)境而合成的一類蛋白。Cu－Zn SOD可以促使細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的H2O2等發(fā)生歧化反應(yīng)，保護(hù)布魯菌不受這些物質(zhì)的影響。Cu－Zn SOD也是一種具有T 細(xì)胞免疫活性的蛋白，能夠刺激S19 疫苗株免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞活化，提高脾臟淋巴細(xì)胞IFN－γ表達(dá)水平［19］。與Gro－EL蛋白一樣，Cu－Zn SOD 也是細(xì)胞免疫診斷靶點(diǎn)抗原的候選之一。從B.abortus RB51菌中提取的Cu－Zn SOD只與B.abortus感染牛的陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與大腸埃希菌O157：H7以及耶爾森菌O：9 的 陽 性 血 清 發(fā) 生 反 應(yīng)［20］。因 此，Cu－Zn SOD 蛋白在布病臨床應(yīng)用中可以有效降低與其他菌的交叉反應(yīng)。

2.4 p39蛋白

p39蛋白（胞質(zhì)結(jié)合蛋白p39）是布魯菌胞質(zhì)結(jié)合蛋白，具有良好的免疫原性。p39是良好的T 細(xì)胞抗原，可誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，并顯著提高IFN－γ的表達(dá)水平。報(bào)道顯示p39在豚鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，在檢測出特異性抗體的同時(shí)，也能檢測到IL－2、IFN－γ 和IL－12 等細(xì)胞因子的產(chǎn)生［21］。Letesson J J等［22］以p15－p39 作 為 抗 原，建立的iELISA 方法具有較高的敏感性，自然感染的綿羊和山羊血清的檢出率分別為80%和96%，表明p39作為診斷抗原具有良好的敏感性和特異性。

3 其他蛋白

3.1 RepA－related蛋白

repA 相關(guān)基因是豬種布魯菌與牛種、羊種布魯菌的差異基因，是牛種強(qiáng)毒株544缺失基因，該基因參與編碼布魯菌功能蛋白。repA 相關(guān)基因在豬種、犬種等布魯菌中存在，而在牛種、羊種布魯菌中缺失，這種差異使RepA－related成為鑒別診斷的靶點(diǎn)之一。武寧等［23］用RepA－related蛋白作為包被蛋白建立了ELISA 檢測方法，通過與RBPT、CFT 等方法對比發(fā)現(xiàn)，該ELISA 方法能夠區(qū)分豬種布魯菌S2疫苗免疫牛與牛種、羊種布魯菌感染牛。

除此之外，通過微矩陣方法，利用不同年齡以及不同感染時(shí)期的病人血清，篩選出的高敏感性BMEII組蛋白可作為布病血清學(xué)診斷的候選抗原［24］。Ciocchini A E等［25］以耶爾森菌O：9的多糖和蛋白結(jié)合物作為抗原建立了糖蛋白結(jié)合物偶聯(lián)磁珠法，其敏感性和特異性分別達(dá)到93%和100%。Brucellacapt方法是一種基于雙抗體夾心ELISA 方法原理的一種免疫捕獲凝集試驗(yàn)，和iELISA 方法對比發(fā)現(xiàn)Brucellacapt方法的敏感性和特異性分別為82.7%和88.9%［26］。

4 小結(jié)

布魯菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，感染機(jī)體之后首先誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行分泌表達(dá)。隨后誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體以抵御病原菌。因此，抗體水平的檢測不能及時(shí)地監(jiān)測布魯菌感染。IFN－γ的分泌是機(jī)體發(fā)生細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)，淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性抗原蛋白刺激后IFN－γ的分泌情況可反映機(jī)體的感染狀態(tài)。因此，對細(xì)胞因子的檢測意義在于能夠及時(shí)反映宿主的感染狀況。Omp和菌體蛋白等具有激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)的潛力，是產(chǎn)生特異性細(xì)胞因子的潛在刺激原及細(xì)胞免疫診斷靶點(diǎn)的候選蛋白，利用這一特點(diǎn)可以為細(xì)胞免疫學(xué)診斷方法的建立提供理論依據(jù)。在牛結(jié)核病的診斷中，使用結(jié)核分支桿菌抗原蛋白及結(jié)核菌素（PPD）刺激外周血進(jìn)行IFN－γ體外釋放試驗(yàn)是主要的一種細(xì)胞免疫診斷方法。通過與標(biāo)準(zhǔn)方法的比對，設(shè)立合理的臨界值，可以將IFN－γ值與結(jié)核病感染緊密的聯(lián)系起來。因此，在布病的細(xì)胞免疫診斷研究中包括使用布魯菌抗原蛋白以及布魯菌素（Br－PPD）進(jìn)行牛外周血IFN－γ 體外釋放試驗(yàn)［9－10，17］也顯示出良好的研究前景。在抗原蛋白及Br－PPD體外刺激下，接種布魯菌疫苗免疫的牛外周血可以釋放大量的IFN－γ，IFN－γ的釋放水平與Br－PPD 皮試試驗(yàn)血清抗體凝集動(dòng)態(tài)變化之間存在相關(guān)性［27］，并且調(diào)高抗原蛋白的刺激濃度可以上調(diào)IFNγ釋放水平［28］。在提高淋巴細(xì)胞IFN－γ釋放水平的基礎(chǔ)上，如能摸索出IFN－γ釋放量與布病感染間的關(guān)系，布病的細(xì)胞免疫診斷方法將有望進(jìn)入臨床應(yīng)用。

近年對于布魯菌蛋白功能的研究有限，隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的不斷成熟，對這些蛋白的研究也會不斷深入。一種或幾種靶點(diǎn)蛋白，在體外通過單一或者結(jié)合的方式刺激特異性細(xì)胞因子的釋放能夠反映布病的感染狀態(tài)，不僅如此，一些特異性的靶點(diǎn)蛋白還可用于區(qū)分自然感染和疫苗接種，這對于布病的診斷具有重大的意義。

［1］ 邢 進(jìn)，王金鋒，趙寶華.布魯菌病及其診斷方法研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（3）：69－73.

［2］ Baily G G，Krahn J B，Drasar B S，et al.Detection of B.melitensis and Brucella abortus by DNA amplification［J］.J Trop Med Hyg，1992，95（4）：271－275.

［3］ Bricker B J，Halling S M.Differentiation of Brucella abortus bv.1，2，and 4，B.melitensis，Brucella ovis，and Brucella suis bv.1by PCR［J］.J Clin Microbiol，1994，32（11）：2660－2666.

［4］ 丁家波，張存帥，彭小兵，等.布魯菌種屬鑒定多重PCR 方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29（5）：594－597.

［5］ 侯慧玉.布魯菌蛋白質(zhì)文庫的建立及感染與免疫鑒別診斷標(biāo)識抗原的研究［D］.北京：中國疾病預(yù)防控制中心，2013.

［6］ 夏淑婷.布魯菌病新的免疫學(xué)診斷靶點(diǎn)的研究［D］.云南大理：大理學(xué)院，2014.

［7］ 萬 婷，孟 闖，陳 祥，等.結(jié)核分支桿菌CFP32蛋白的原核表達(dá)及其細(xì)胞免疫學(xué)檢測價(jià)值評價(jià)［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2014，30（6）：60－64.

［8］ Tittarelli M，Massis D F，Bonfini B，et al.An ELISA for the evaluation of gamma interferon production in cattle vaccinated with Brucella abortus strain RB51［J］.Vet Ital，2009，45（2）：355－361.

［9］ Ferrer D M，Leon L，Nielsen K，et al.Antibody response and antigen－specific gamma－interferon profiles of vaccinated and unvaccinated pregnant sheep experimentally infected with B.melitensis［J］.Vet Microbiol，2004，100（3）：219－231.

［10］ Gupta V K，Shivasharanappa N，Kumar V，et al.Diagnostic evaluation of serological assays and different gene based PCR for detection of B.melitensis in goat［J］.Small Rumin Res，2014，117（1）：94－102.

［11］ 陳 瑤，李 明.布魯菌bp26 和omp10 基因的原核表達(dá)和鑒定［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22（4）：313－317.

［12］ Gupta V K，Rout P K，Vihan V S.Induction of immune response in mice with a DNA vaccine encoding outer membrane protein（Omp31）of B.melitensis 16M［J］.Res Vet Sci，2007，82（3）：305－313.

［13］ Wang W，Wu J，Qiao J，et al.Evaluation of humoral and cellular immune responses to BP26and OMP31epitopes in the attenuated B.melitensis vaccinated sheep［J］.Vaccine，2014，32（7）：825－833.

［14］ Arese A，Cravero S，Boschiroli M，et al.Use of a recombinant protein fromBrucella abortus for the diagnosis of brucellosis in different animal species［J］.Rev Argent Microbiol，1998，31：36－39.

［15］ 唐利燕，陳創(chuàng)夫，王遠(yuǎn)志，等.布魯菌bp26 基因的原核表達(dá)及Bp26 間接ELISA 方法的初步建立［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，27（4）：437－440.

［16］ 張小娟，賈廣樂，廖娟紅，等.布魯菌OMP28 蛋白的原核表達(dá)與間接ELISA 方法的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（1）：6－11.

［17］ Tabynov K，Kydyrbayev Z，Ryskeldinova S，et al.Novel influenza virus vectors expressing Brucella L7／L12or Omp16 proteins in cattle induced a strong T－cell immune response，as well as high protectiveness against B.abortus infection［J］.Vaccine，2014，32（18）：2034－2041.

［18］ Velikovsky C A，Cassataro J，Giambartolomei G H，et al.A DNA vaccine encoding lumazine synthase fromBrucella abortus induces protective immunity in BALB／c mice［J］.Infect Immun，2002，70（5）：2507－2511.

［19］ 王遠(yuǎn)志，陳創(chuàng)夫，崔步云，等.綿羊附睪種布魯菌O19株外膜蛋白基因序列比較研究［J］.疾病監(jiān)測，2010，25（9）：734－736.

［20］ Kim J Y，Sung S R，Lee K，et al.Immunoproteomics of Brucella abortus RB51as candidate antigens in serological diagnosis of brucellosis［J］.Vet Immunol Immunopathol，2014，160（3）：218－224.

［21］ 楊星雅，崔步云.布魯菌蛋白免疫原性研究進(jìn)展［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28（2）：155－158.

［22］ Letesson J J，Tibor A，Eynde V G，et al.Humoral immune responses of Brucella－infected cattle，sheep，and goats to eight purified recombinant Brucellaproteins in an indirect enzyme－linked immunosorbent assay［J］.Clin Diagn Lab Immunol，1997，4（5）：556－564.

［23］ 武 寧，王晶鈺，劉萬華，等.布魯菌S2 疫苗株免疫牛與牛種，羊種布魯菌自然感染牛ELISA 鑒別診斷方法的建立［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，34（2）：243－247.

［24］ Xu J，Qiu Y，Cui M，et al.Sustained and differential antibody responses to virulence proteins of B.melitensis during acute and chronic infections in human brucellosis［J］.Eur J Clin Microbiol，2013，32（3）：437－447.

［25］ Ciocchini A E，Serantes D A R，Melli L J，et al.Development and validation of a novel diagnostic test for human brucellosis using aglyco－engineered antigen coupled to magnetic beads［J］.PLoS Negl Trop Dis，2013，7（2）：e2048.

［26］ 趙 娜，趙赤鴻，榮 蓉，等.布魯菌病血清學(xué)Brucellacapt和iELISA 檢測方法的比較［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2014，30（10）：1045－1047.

［27］ 楊宏軍，李旭妮，張 亮，等.布魯菌S19疫苗免疫奶牛血清凝集抗體的動(dòng)態(tài)變化與水解素皮膚變態(tài)反應(yīng)相關(guān)分析［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，45（2）：11－14.

［28］ Cannella A P，Arlehamn C S L，Sidney J，et al.B.melitensis T cell epitope recognition in humans with brucellosis in peru［J］.Infect Immun，2014，82（1）：124－131.