莢膜多糖及其疫苗研究進展

張 哲，李新圃，楊 峰，羅金印，王旭榮，劉龍海，李宏勝＊

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室 甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州730050）

莢膜是細菌的特殊結(jié)構(gòu)，存在于一些細菌細胞壁外的一層黏液性物質(zhì)，可保護細菌免受抑菌或殺菌物質(zhì)的侵害以及宿主吞噬細胞的吞噬，同時還有助于細菌黏附于宿主細胞表面以誘發(fā)感染，是細菌得以生存的重要表面結(jié)構(gòu)。有些細菌的莢膜成分主要為多糖，是細菌重要的保護性抗原和毒力因子，同時也是細菌結(jié)構(gòu)變化最少的表面抗原，具有較好的免疫原性，是最適宜做疫苗的靶抗原之一［1－2］。莢膜多糖（capsular polysaccharide，CP）具有良好的免疫原性，被廣泛應用于多糖疫苗的研制。莢膜多糖疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，其成分單一，不存在易引起免疫副反應的物質(zhì)，使得該類疫苗更為安全、有效，已成為應用最多的疫苗之一［3］。本文從莢膜多糖的生物學作用，作用機制，提取合成工藝及影響因素，莢膜多糖疫苗的研制及應用，莢膜多糖疫苗的發(fā)展前景以及存在的問題等方面進行了綜述，以期為進一步了解和研究該類疫苗積累資料。

1 莢膜多糖的生物學作用

許多細菌，如肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、B 群鏈球菌、B型流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門菌等，其表面都有莢膜［4］。莢膜多糖既是基本的毒力因子也是細菌重要的保護性抗原，對于細菌的生長繁殖有著重要的作用。莢膜多糖的作用主要表現(xiàn)在：①黏附作用 莢膜多糖能夠促進細菌與細胞表面或細菌之間的黏附，從而促進生物被膜的形成和細菌在不同環(huán)境中的定植。②耐干燥 莢膜層含水量在95%以上，圍繞在細菌的表面，可以保護細菌免受脫水的損害。③抵抗宿主非特異性免疫 莢膜處于細菌最外層，可有效保護菌體免受或少受多種殺菌、抑菌物質(zhì)的損傷；在生理pH 條件下，大部分細菌莢膜多糖帶負電，可阻止帶同種電荷的吞噬細胞的吞噬；且莢膜位于細菌的表面，能干擾宿主補體系統(tǒng)的激活［5］。④抵抗宿主特異性免疫 大部分細菌的莢膜多糖都可誘導宿主產(chǎn)生特異性免疫反應，但少數(shù)細菌的莢膜多糖免疫原性極低，如B群腦膜炎奈瑟菌的莢膜多糖與哺乳動物的胚胎組織及神經(jīng)節(jié)苷脂中均含有乙酰神經(jīng)氨酸組分；大腸埃希菌K5莢膜多糖具有與未硫酸化肝素類似的多糖重復骨架，而宿主的組織多糖也有與上述結(jié)構(gòu)相似的組分。這類細菌的莢膜多糖免疫原性低，使得這些細菌能夠抵抗宿主特異性免疫。

2 莢膜多糖的作用機制

莢膜多糖的發(fā)現(xiàn)最早可追溯至1917年Dochez和Avery發(fā)現(xiàn)的由肺炎球菌分泌于細胞壁外的一種可溶性物質(zhì)，這種物質(zhì)后來被證實為碳水化合物。1927年有學者研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠注射肺炎球菌莢膜多糖可起到免疫保護作用，從而證實莢膜多糖具有免疫原性。但莢膜多糖是2型非T 細胞依賴性（TI－2）抗原，進入機體后無需Th細胞就能激發(fā)B 細胞產(chǎn)生相應的IgM 抗體，但不能產(chǎn)生IgG 抗體且無記憶性B細胞產(chǎn)生［6］。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎莢膜多糖疫苗能降低老年人患肺炎的風險［7－8］，有效期為5 年，且對于女性患者的保護率大與男性患者，但小于2歲的兒童對該疫苗的抗體應答較弱甚至無應答。這可能是由于嬰幼兒體內(nèi)的B淋巴細胞表面尚未形成足夠數(shù)量的IgM 受體分子，單純莢膜多糖不能使B 細胞表面形成帽狀結(jié)構(gòu)從而誘導抗體產(chǎn)生。此外，對莢膜多糖抗原的免疫應答需要功能完整的脾臟。在嬰兒出生后5 個月內(nèi)，脾臟邊緣區(qū)（marginalzone，MZ）仍未發(fā)育成熟，2歲以下幼兒MZ B細胞上的Ⅱ型補體受體的表達水平低下或缺失，因此單純的莢膜多糖疫苗對嬰幼兒的免疫原性低、不能誘導其產(chǎn)生免疫記憶應答，僅有短期的保護作用。

1929年Goebel及Avery 發(fā)現(xiàn)，將肺炎鏈球菌莢膜多糖共價偶聯(lián)到蛋白載體上，免疫家兔能提高莢膜多糖的免疫原性，誘導T 細胞依賴性抗體的產(chǎn)生，這一理論首先被B 型流感嗜血桿菌（Hib）結(jié)合疫苗的成功研制所證實。將莢膜多糖與合適的蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)，賦予莢膜多糖成分“載體效應”，就可克服不能產(chǎn)生以IgG 為主的抗體和無加強免疫應答效應的不足。試驗證實這種共價結(jié)合抗原能誘發(fā)T細胞依賴性免疫應答反應，激活T 細胞分泌細胞因子，可增加嬰幼兒體內(nèi)血清抗體效價，誘導機體產(chǎn)生持久的免疫記憶反應。當多糖與載體蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)免疫動物后，多糖－蛋白質(zhì)結(jié)合物通過胞飲作用進入B細胞，在細胞內(nèi)被水解成抗原肽，然后與胞質(zhì)內(nèi)MHCⅡ類抗原結(jié)合，形成抗原肽－MHCⅡ復合物并被分泌到B 細胞表面，從而可與Th細胞表面識別受體結(jié)合，促使該Th細胞活化、增殖并分泌一系列的細胞因子，這些細胞因子又可促使B 細胞增殖分化，產(chǎn)生IgG 和IgM 抗體，在增殖分化過程中有少量B細胞停止分化成為記憶性B 細胞［9］。據(jù)此，人們將莢膜多糖與合適的蛋白質(zhì)分子進行偶聯(lián)制成了莢膜多糖結(jié)合疫苗，克服了莢膜多糖疫苗存在的部分缺陷。

3 莢膜多糖的提純工藝及合成影響因素

3.1 莢膜多糖的提取及純化過程

莢膜多糖作為疫苗抗原，需有較強的免疫原性與足夠的安全性。影響其免疫原性的因素很多，主要包括多糖分子質(zhì)量大小、結(jié)構(gòu)的完整性及特殊化學基團的含量。多糖中殘存的核酸、蛋白質(zhì)、致熱源物質(zhì)和純化相關(guān)的試劑，是影響疫苗安全性的重要因素。為提高莢膜多糖疫苗的免疫原性，一般要對提取的莢膜多糖進行純化，以達到最佳免疫效果。

3.1.1 去除菌體和收集總糖 傳統(tǒng)工藝中，去除菌體主要用離心沉淀法，但其效果依賴于高效率的設備投入，現(xiàn)已逐漸被十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）法所取代。CTAB 是一種陽離子去污劑，能與多糖形成季胺絡合物而沉淀多糖，并可共沉淀大部分的核酸和蛋白質(zhì)［10］。CTAB 的沉淀作用與其濃度、pH、溫度等因素有關(guān)。有報道指出，CTAB濃度越高，莢膜多糖沉淀效果越好；溫度越高，效果越 差［11］。陳作 江 等［12］試 驗 表 明，過 高 的CTAB 濃度不能增加其產(chǎn)量，且會增加復合多糖解離的難度。此外，超濾技術(shù)，如中空纖維法已逐步被用于莢膜多糖的提取與純化。根據(jù)不同莢膜多糖分子的大小，選擇適宜孔徑大小的超濾膜，在起到濃縮作用的同時，還可去除比莢膜多糖小的大部分雜質(zhì)［13］。

3.1.2 去除核酸與蛋白質(zhì) 傳統(tǒng)的莢膜多糖提取純化工藝中，去除核酸與蛋白質(zhì)多采用有機溶劑沉淀法。去除核酸常使用乙醇，離心除去核酸沉淀；去除蛋白質(zhì)則主要靠苯酚抽提。鑒于有機試劑的毒性，人們嘗試了無機物沉淀法。Kothari S等［14］在純化傷寒Vi多糖時，采用無機物（硫酸銨）來沉淀多糖，結(jié)果表明硫酸銨能有效去除核酸。核酸和蛋白質(zhì)都能被各自特異性的酶水解，但酶活性的發(fā)揮需要適宜的外界條件，且加入的酶無疑是一種外源性物質(zhì)，因此對酶的來源有嚴格的要求。Takagi M等［11］在提純Hib莢膜多糖時，以核酸內(nèi)切酶降解核酸，鏈霉蛋白酶E和胰蛋白酶降解蛋白質(zhì)，最終獲得了符合相關(guān)規(guī)定的Hib莢膜多糖。

3.1.3 去除內(nèi)毒素 內(nèi)毒素即脂多糖（LPS），可引起人畜的發(fā)熱、微循環(huán)障礙及休克等。去除內(nèi)毒素可用超速離心法，但超速離心機十分昂貴、操作不便，且工藝放大較難。目前，傳統(tǒng)的超速離心法正在被一種優(yōu)化的超濾法所代替。由于脂多糖在水相中形成高分子聚合物，且其相對分子質(zhì)量接近莢膜多糖，因此一般的超濾法很難除去內(nèi)毒素。乙二胺四乙酸（EDTA）可以螯合LPS表面的帶電離子，使帶負電的LPS 相互排斥而解離成單體；脫氧膽酸鈉（DOC）可以破壞LPS的疏水作用使其解聚，解聚的單體便可經(jīng)超濾去除。總之，隨著對疫苗質(zhì)量標準和環(huán)保要求的不斷提高，一些舊的生產(chǎn)工藝正逐漸被淘汰，乙醇、苯酚等試劑將逐漸被限制使用。對超濾、酶解及無機物沉淀等方法的探索研究，將有望開發(fā)出一套安全有效的莢膜多糖提取純化工藝。

3.2 影響莢膜多糖合成的因素

細菌莢膜多糖的生物合成是一個與酶作用相關(guān)的復雜過程。該過程起始于對單糖的吸收或合成以及單糖對核苷酸誘導劑的激活，接著由膜結(jié)合轉(zhuǎn)移酶復合物將已成功耦聯(lián)的單糖催化形成一種膜結(jié)合脂質(zhì)載體，最后由聚合酶類催化寡糖亞基的聚合，聚合完成后由運輸因子將其輸出胞外，并將完整的莢膜多糖錨定于細胞表面。莢膜多糖合成過程受到許多因素的影響，主要包括以下幾個方面：

3.2.1 培養(yǎng)基成分 胞外莢膜多糖產(chǎn)生的量和多糖組成，往往與培養(yǎng)基中可利用碳源的種類有關(guān)。楊正濤等研究表明，與哥倫比亞培養(yǎng)基比較，BHI培養(yǎng)基降低了莢膜多糖產(chǎn)量，而mod 110培養(yǎng)基可提高其產(chǎn)量；同種培養(yǎng)基，以乳糖作為碳源可提高莢膜多糖產(chǎn)量。

3.2.2 二氧化碳含量 Herbert S等［15］1997年首次報道CO2作為一種環(huán)境信號可以調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌5型莢膜多糖（CP5）的表達。當培養(yǎng)環(huán)境中增加5%的CO2時，CP5表達量顯著減低，CO2在基因轉(zhuǎn)錄水平上，影響了莢膜多糖基因的表達。而后續(xù)的研究表明，CP8的表達并非總隨CO2含量的增加而降低，這可能與cap基因啟動子序列的不同有關(guān)。

3.2.3 氧氣含量 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果表明，溶解氧能促進莢膜多糖的產(chǎn)生，并且能使菌體在對數(shù)生長期之后仍然能持續(xù)形成莢膜多糖。假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌屬以及黃單胞菌在提供高溶氧的條件下能大量產(chǎn)生胞外多糖［16］。Linton 研究證明，在生物合成過程中，菌體對能量的需求伴隨著對溶氧的需求，進而合成胞外多糖。

3.2.4 pH 的影響 培養(yǎng)基的pH 值也能夠影響微生物胞外多糖的產(chǎn)生量。江元翔等在對腦膜炎球菌培養(yǎng)條件進行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，在pH 為6.6左右時，其莢膜多糖產(chǎn)量最高。在pH6.0～pH7.0 之間，Reynolds菌株在對數(shù)生長期之后仍然能夠持續(xù)產(chǎn)生莢膜多糖；但是在pH8.0時，對數(shù)生長期之后基本再無莢膜多糖的產(chǎn)生，且最終莢膜多糖的總量較少。

4 莢膜多糖疫苗的研制及應用

由于莢膜多糖具有良好的免疫原性，目前以莢膜多糖為靶抗原已成功制備了多種細菌疫苗，這些疫苗在疾病的預防和控制方面發(fā)揮了巨大的作用，大大降低了相關(guān)疾病的發(fā)病率。由于單純的莢膜多糖疫苗存在很多缺陷，目前的研究主要集中在莢膜多糖結(jié)合疫苗。

4.1 人用莢膜多糖疫苗的研究

4.1.1 肺炎球菌莢膜多糖疫苗 肺炎球菌根據(jù)其莢膜多糖成分的不同，按照“丹麥命名系統(tǒng)”，可將其分成48個血清群91個血清型。在全球范圍內(nèi)，有20種血清型與超過85%的肺炎有關(guān)，其中13種最常見的血清型與70%～75%的兒童侵襲性肺炎有關(guān)。1978年，含14個血清型的肺炎鏈球菌14價莢膜多糖疫苗（PPV14）在美國正式上市；1983 年，世界衛(wèi)生組織建議用新研制的23 價莢膜多糖疫苗（PPV23）代替PPV14；成都生物制品研究所于2000年研制出PPV23，并于2006 年上市。有關(guān)PPV23的研究表明，PPV23對相應疾病的保護率為50%～70%，但小于2歲的兒童對該疫苗的抗體應答較弱甚至無應答［8］。肺炎球菌7 價結(jié)合苗（PCV7）于2000年獲準上市，但研究表明，該疫苗的應用使得非疫苗型肺炎球菌所致疾病的發(fā)病率升高了25%。為降低血清型替代造成的影響，2009年－2010年，10價和13 價結(jié)合疫苗又分別被批準上市［17］。其中，輝瑞開發(fā)的Prevenar13是目前使用最廣的肺炎球菌疫苗，已獲全球120多個國家批準［18］。國內(nèi)目前有四家企業(yè)正在研制PCV13，且均已進入臨床試驗申報程序。

4.1.2 腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗 腦膜炎奈瑟菌（Nm）俗稱腦膜炎球菌，是流行性腦脊髓膜炎的病原菌。根據(jù)其莢膜多糖的不同，腦膜炎球菌可分為13個血清群，其中A、B、C、Y 和W－135群是主要的致病血清群［19］。1981年，第一個A、C、W－135及Y 型腦膜炎球菌四價多糖疫苗在美國獲得上市。我國從1972年開始試制Nm 多糖疫苗，目前國內(nèi)上市的腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗（MenV）主要有4種，包括A群MenV、A＋C群MenV、A、C、Y、W－135群MenV和A＋C群MenV 結(jié)合疫苗。這四種疫苗經(jīng)試驗證實具有良好的免疫原性、安全性及穩(wěn)定性［20］。A、C、Y、W－135群流腦結(jié)合疫苗已在國外上市，由我國沃森生物技術(shù)有限公司研制的莢膜多糖結(jié)合疫苗已于2015年2月進入臨床研究階段。

4.1.3 傷寒莢膜多糖疫苗 傷寒是由傷寒沙門菌引起的一種急性傳染病，全球每年發(fā)生的傷寒病例在2 160萬～2 690萬之間，2000年約有21萬病人死亡［21］。自19世紀末首次應用傷寒菌體菌苗預防傷寒以來，各國先后研制出10余種傷寒菌苗，但多數(shù)由于免疫效果差或副作用大而被淘汰。目前，國際上以傷寒Vi多糖疫苗的應用占絕大多數(shù)，該疫苗是從傷寒沙門菌的莢膜多糖中提取純化的Vi多糖制成。與滅活疫苗相比，Vi多糖疫苗具有安全性好、副反應低、使用方便等優(yōu)點。但該疫苗對2歲以下兒童無效，為此，國內(nèi)外不少機構(gòu)開始研制結(jié)合疫苗，美國國立衛(wèi)生研究所（NIH）將傷寒桿菌Vi多糖與重組綠膿桿菌外毒素A（rEPA）偶聯(lián)制備出了Vi多糖結(jié)合疫苗［22］。我國蘭州生物制品研究所率先開展了Vi－rEPA 結(jié)合疫苗的研制。玉溪沃森生物技術(shù)有限公司研制的傷寒Vi多糖結(jié)合疫苗，目前正處于臨床試驗申請階段。

4.1.4 Hib 莢 膜 多 糖 疫 苗 B 型 流 感 嗜 血 桿 菌（Hib）是兒童鼻咽腔常見的寄生菌，可引起兒童肺炎和腦膜炎，全球每年約38.6萬患者死亡［23］。Hib莢膜多糖主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸鹽（PRP），具有較好的免疫原性。1985年美國和芬蘭首次以PRP制備的Hib莢膜多糖疫苗，并用于兒童免疫。隨著Hib結(jié)合疫苗成功研制，PRP疫苗已被Hib結(jié)合疫苗所取代。目前市場上主要有4種Hib結(jié)合疫苗［24］，分別為以白喉類毒素、減毒白喉類毒素、腦膜炎雙球菌外膜蛋白和破傷風類毒素為載體的莢膜多糖結(jié)合疫苗。

4.2 獸用莢膜多糖疫苗研究

與人用莢膜多糖疫苗的研究相比，獸用莢膜多糖疫苗的研發(fā)起步較晚。目前，獸用莢膜多糖疫苗的研究主要集中在奶牛乳房炎疫苗開發(fā)方面。奶牛乳房炎是奶牛業(yè)最嚴重的疾病之一，已嚴重影響畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康。由于疫苗接種預防乳房炎具有安全無毒的特點，被認為是一種較為安全、有效的方法［25］。引起奶牛乳房炎的病原菌多達150 多種，但95%以上的乳房炎是由鏈球菌、葡萄球菌和大腸埃希菌引起。因此，用這幾種病原菌制備疫苗用來預防乳房炎是國內(nèi)外學者研究的重點［26－27］。

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎最主要的一種病原菌。據(jù)報道，從美國和歐洲的奶牛乳房炎病乳中分離的金黃色葡萄球菌，分別有100%和98%血清型為5型、8型和336型。Fattom A 等［28］將5型、8型的莢膜多糖偶聯(lián)到綠膿桿菌外毒素A 或白喉毒素上，可有效預防金黃色葡萄球菌性乳房炎。Edridge等將純化的金黃色葡萄球菌血清型5型、8型和336型的莢膜多糖結(jié)合到載體蛋白和可生物降解的微球中，可提高其調(diào)理性抗體效價。林樹乾等2006年將提取的莢膜多糖與牛血清白蛋白偶聯(lián)，制成了多糖結(jié)合疫苗。關(guān)于鏈球菌疫苗的研究較少，主要是關(guān)于無乳鏈球菌和乳房鏈球菌，但效果都不理想。Poutrelr等用一種絕大多數(shù)鏈球菌都有的蛋白X 與B族鏈球菌莢膜多糖偶聯(lián)組成的疫苗，能誘導調(diào)理性抗體產(chǎn)生。然而，到目前為止尚無有效預防鏈球菌性乳房炎的商品化疫苗面市。關(guān)于大腸埃希菌莢膜多糖疫苗的研究尚未見報道。

在經(jīng)歷了三次疫苗革命后，對于奶牛乳房炎的防治取得很大進展，但還未能得到根本的解決。提高抗原的免疫原性以及乳腺的反應強度，利用分子生物學技術(shù)進一步改進疫苗的設計程序，選擇交叉血清性強的菌株以抵抗更多的血清型病原的感染，將是今后奶牛乳房炎疫苗研制的重點。

5 前景及展望

莢膜多糖作為細菌的重要表面抗原，其結(jié)構(gòu)特征、合成機制與生物功能，已越來越受到人們重視。莢膜多糖疫苗作為一種新型疫苗，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，已從最初單純的多糖疫苗發(fā)展到現(xiàn)在的多糖結(jié)合疫苗，對傳染病的防控具有重大意義。莢膜多糖疫苗價格便宜，免疫僅需一針，更適用于經(jīng)濟落后地區(qū)相關(guān)疾病的防控。多糖結(jié)合疫苗研發(fā)困難，價格較高，但它能激發(fā)≤2歲兒童、老年人和免疫缺陷者產(chǎn)生有效的免疫應答，且能維持較長時間。因此，兩種疫苗的并存有利于優(yōu)勢互補，對我國相關(guān)疾病的預防和控制具有重要意義。由于致病菌血清型的增多，使得人們不得不研發(fā)包含更多血清型的多價結(jié)合疫苗。這一方面增加了疫苗研發(fā)的難度，使得結(jié)合疫苗的制備成本增高，限制了其在發(fā)展中國家的應用；另一方面，隨著結(jié)合疫苗價數(shù)和載體蛋白劑量的增加，結(jié)合物之間或共免疫抗原之間產(chǎn)生干擾的可能性就越大。因此，廉價有效的結(jié)合疫苗應是今后研發(fā)的重點。隨著對結(jié)合疫苗免疫機制的進一步了解以及新型載體蛋白的不斷發(fā)現(xiàn)，研發(fā)更有效廉價的莢膜多糖結(jié)合疫苗是十分有希望的。

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