小反芻獸疫病原及疫苗的研究進(jìn)展

吳炳秀 和麗英 云南省迪慶州香格里拉縣建塘鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站 674400

1 病原

反芻獸疫是由小反芻獸疫病毒引起的一種嚴(yán)重的傳染病，主要感染小反芻動物，特別是山羊高度易感。該病毒是副黏病毒科、麻疹病毒屬的成員，同屬的其他成員還有牛瘟病毒、犬瘟熱病毒和海豹瘟病毒等。該病毒外有8.5～14.5nm 厚的囊膜，囊膜上有8～15nm 的纖突，纖突只含血凝素而無神經(jīng)氨酸酶，但同時具有神經(jīng)氨酸酶和血凝素活性；核衣殼總長約1000nm，呈螺旋對稱，直徑約18nm，螺距5～6nm，并且核衣殼纏繞成團。小反芻獸疫病毒粒子在pH 值為5.85～9.5 之間穩(wěn)定，在pH 值為4.0 以下或pH 值為11.0 以上很快就失活。對乙醚、酒精和一些去污劑敏感，乙醚4℃時經(jīng)12 小時可將其滅活；用非離子水去污劑可使病毒所有的纖突脫落；酚、2%的NaOH 24小時可將其滅活。該病毒粒子雖然含有血凝素，但是不能對猴、牛、綿羊、山羊、馬、豬、犬、豚鼠等大多數(shù)哺乳動物和禽的紅細(xì)胞具有凝集性。國際動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病定為A 類動物疫病，我國規(guī)定為一類動物疫病。

2 疫苗研究進(jìn)展

（1）小反芻獸疫弱毒疫苗。1989年，Diallo 等通過Vero 細(xì)胞的連續(xù)傳代，成功研制了Nigeria 75/1 PPR弱毒疫苗，該疫苗無任何副作用。盡管PPRV Nigeria 75/1 屬于I 群，但能交叉保護其他群毒株的攻擊感染。但由于PPRV 對熱高度敏感，致使Nigeria 75/1 疫苗的穩(wěn)定性很差，不利于基層運輸和使用。用氯仿滅活制備的PPRV 滅活疫苗.在4℃可以保存1年，免疫山羊后血清抗體可持續(xù)保存8 個月。但缺點是該疫苗株和野毒株無法區(qū)分。為了區(qū)別疫苗免疫和強毒感染，2003年，Diallo 等通過反向遺傳操作技術(shù)，研制出基因工程標(biāo)記苗，能夠?qū)⒁呙缰昱c野毒株區(qū)分開來。此外，印度利用山羊痘和小反芻獸疫二價弱毒疫苗來免疫羊群，4 周后可抵御強毒的攻擊，具有很好的安全性和免疫原性。法國和英國的科學(xué)家把PRRV 的F 和H 基因克隆到山羊痘疫苗中，利用重組疫苗有效地預(yù)防小反芻獸疫的發(fā)生。至今，弱毒疫苗Nigeria75/1 仍是OIE 規(guī)定的唯一允許使用的小反芻獸疫病毒疫苗。我國于2007年7月首次在西藏地區(qū)發(fā)生小反芻獸疫疫情，于2007年10月生產(chǎn)出第一批小反芻獸疫活疫苗Nigeria75/1 株，用于西藏和新疆部分地區(qū)的緊急免疫。印春生等通過對該疫苗

進(jìn)行臨床應(yīng)用研究，結(jié)果表明該疫苗在田間大規(guī)模使用是安全有效的，疫苗具有良好的免疫原性和較長的免疫持續(xù)性。同其他的副黏病毒一樣，小反芻獸疫病毒對熱非常敏感，這成為了在熱帶疫區(qū)使用活毒疫苗最大的障礙，而且在這些地區(qū)基礎(chǔ)設(shè)施較為落后，難于實現(xiàn)疫苗的低溫運輸和保存，為克服這一障礙，Worwall 等通過添加含海藻糖的穩(wěn)定劑研制出了熱穩(wěn)定性凍干疫苗，該疫苗能夠在45℃條件下保存14天，這種熱穩(wěn)定性疫苗對小反芻獸疫的防控起到了很大的作用。

（2）滅活疫苗。小反芻獸疫滅活疫苗采用感染山羊的病理組織制備，一般采用甲醛或氯仿滅活。用甲醛滅活的疫苗免疫效果不理想，而用氯仿滅活的疫苗效果較好。

（3）DIVA 疫苗。為了能夠在進(jìn)行免疫計劃的同時開展血清學(xué)調(diào)查，科學(xué)家開始研究一種DIVA 標(biāo)記疫苗。小反芻獸疫病毒感染時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體主要為含量最豐富的N 蛋白和具有中和活性的表面糖蛋白H，因此，小反芻獸疫疫苗最佳的模式就是構(gòu)建能夠表達(dá)小反芻獸疫N、H 蛋白的一種重組病毒。Das SC 等以牛瘟病毒基因組為骨架，將其糖蛋白基因F和H 分別替換為小反芻獸疫病毒相應(yīng)的基因構(gòu)建了一種用于防控小反芻獸疫的嵌合疫苗。因為這種牛瘟病毒、小反芻獸疫病毒FH 重組病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中生長繁殖狀態(tài)不理想，為了改善重組病毒的生長情況，將牛瘟病毒的M 基因也做了替換，在小范圍試驗中，這種嵌合疫苗可以保護山羊不受小反芻獸疫病毒強毒株的攻擊，但相關(guān)的鑒別診斷技術(shù)仍在研究之中。

（4）基因工程疫苗?；蛑亟M疫苗。麻疹病毒屬的表面糖蛋白具有良好的免疫原性，將F 或H 基因在各種載體中表達(dá)可用作有效的亞單位疫苗,均能刺激機體產(chǎn)生體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。羊痘和小反芻獸疫都是小反芻動物的烈性傳染病，將小反芻獸疫病毒的F 基因插入減毒痘病毒的TK 基因編碼區(qū)，可以構(gòu)建重組羊痘病毒疫苗。重組二價疫苗既可抵抗強毒的攻擊感染，同時也能預(yù)防羊痘病毒的感染。南文金等將小反芻獸疫病毒糖蛋白基因H 插入到山羊痘病毒通用轉(zhuǎn)移載PtkPgpt-egfpP 啟動p7.5 子下游，構(gòu)建了重組山羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體PtkPgpt-egfpP-H 并成功轉(zhuǎn)染到綿羊睪丸細(xì)胞中，為研究小反芻獸疫基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。王芳等選用腺病毒活病毒載體，插入人工合成密碼子優(yōu)化的小反芻獸疫病毒H 基因，成功構(gòu)建了表達(dá)小反芻獸疫病毒H 基因的復(fù)制缺陷性重組人腺病毒載體疫苗候選株。

（2）嵌合體疫苗。嵌合體疫苗是用PPRV 單獨或多個糖蛋白基因替代 RPV 基因組中相應(yīng)的糖蛋白基因。這種疫苗不僅可以對PPRV 產(chǎn)生完全的保護力，而且免疫動物血清中無特異的RPV ELISA 抗體，排除了疫苗免疫對RPV 的血清學(xué)干擾。據(jù)相關(guān)研究表明，用PPRV 的F 和H 蛋白基因單獨或二者同時替代RPV 疫苗基因組中的相應(yīng)蛋白基因，這種嵌合體疫苗不僅安全高效，而且具有標(biāo)記疫苗的優(yōu)點，可用ELISA 方法將自然感染和免疫動物進(jìn)行鑒別。嵌合體疫苗為PPRV 疫苗的研制提供了新的方向。

（3）活載體疫苗。目前使用的疫苗均為弱毒疫苗，存在安全隱患，因此，活載體疫苗的發(fā)展前景被研究者們看好。Berhe 等以羊痘病毒為活載體，將PPRV的F 基因插入其TK 基因編碼區(qū)內(nèi)，構(gòu)建了重組羊痘病毒疫苗。用該疫苗對動物進(jìn)行免疫后攻毒，結(jié)果顯示當(dāng)免疫量為0.1 CFU 時即可起到抵抗PPRV 強毒的攻擊，同時也能預(yù)防羊痘病毒的感染。

（4）核酸疫苗。研究PPRV 核酸疫苗具有十分現(xiàn)實的意義。用核酸疫苗進(jìn)行免疫類似于自然感染，將抗原以自然方式呈遞于免疫系統(tǒng)，不涉及抗原表位的變化，可誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的體液和細(xì)胞免疫，同時核酸疫苗安全可靠、生產(chǎn)方便、成本低廉。Seth 等構(gòu)建了PPRV H 基因的真核表達(dá)載體，并在動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，獲得了具有生物活性的PPRV H 蛋白。國內(nèi)也有研究者構(gòu)建了包含PPRV F 和H 基因的3 種真核表達(dá)載體，將3 種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后均成功表達(dá)。將3 種重組核酸疫苗免疫山羊并進(jìn)行特異性抗體檢測，發(fā)現(xiàn)于第4 周抗體水平達(dá)到峰值，與在第3 周達(dá)到抗體峰值的弱毒疫苗相比，重組核酸疫苗抗體水平明顯較高。以上研究為PPRV 核酸疫苗的正式研制奠定了重要的試驗基礎(chǔ)。與其他疫苗等相比，核酸疫苗有以下特點：核酸疫苗不存在毒力返強和散毒的危險，免疫應(yīng)答持久，制備簡單、省時省力，不受母源抗體干擾。雖然核酸疫苗優(yōu)點顯著，但畢竟其研究與發(fā)展的歷史比較短暫，不可避免地存在許多問題，尚待進(jìn)一步研究解決。

（5）植物疫苗。植物疫苗作為一種口服疫苗在防控PPR 方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景。與傳統(tǒng)疫苗相比，植物疫苗具有生產(chǎn)成本低、易于保存、具有天然的免疫原性、免疫途徑更加安全、免疫途徑更加有效、易于推廣的特點。Khandelwal A 等應(yīng)用基因工程的方法在花生植物中表達(dá)了PPRV H 蛋白，獲得的H 蛋白不但具有生物活性，而且其抗原表位具有天然構(gòu)象。以該花生植物的鮮葉飼喂山羊后，在山羊體內(nèi)激發(fā)了抗H 蛋白的特異性細(xì)胞免疫。今后隨著研究的不斷深入，應(yīng)該會有更多用于PPR 防控的植物疫苗問世。

（6）RNA 干涉技術(shù)。盡管目前已有有效控制PPRV 和RPV 的疫苗，但一般疫苗都是在接種動物后第14天才能起到免疫保護作用，在緊急情況下，希望有一種治療制劑來控制PPR 病毒感染。通過合成的小干擾RNA(siRNA)作用于N 蛋白基因的2 個區(qū)，導(dǎo)致病毒復(fù)制減少了80%以上，通過實時定量PCR 檢測病毒RNA、流式細(xì)胞儀測定病毒蛋白的產(chǎn)生、CPE 評價病毒粒子的產(chǎn)生和測定病毒效價評價siRNA 對PPRV復(fù)制的影響，證明siRNA 分子有發(fā)展為PPRV 和RPV治療制劑的潛力。

3 展望

PPR 已經(jīng)嚴(yán)重影響了我國羊養(yǎng)殖業(yè)，制約著羊養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，而目前使用的弱毒苗具有不耐熱、穩(wěn)定性差、不易運輸和保存的特點，因此有效研究PPRV 的感染、入侵、復(fù)制、致病及免疫特性，開發(fā)一種對熱不敏感、易于運輸和保存、免疫持續(xù)時間較長、安全高效的新型多價苗成為有效防控PPR 的關(guān)鍵。另外，我國應(yīng)加強做好小反芻獸疫流行病學(xué)調(diào)查、病原學(xué)監(jiān)測和免疫預(yù)防工作，密切關(guān)注疫病流行動態(tài)信息，有效防止疫情傳入境內(nèi)，一旦發(fā)現(xiàn)PPR 疫情，應(yīng)積極采取撲殺、隔離、消毒及無害化等綜合處理措施。

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