EZH2蛋白在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育中的表達(dá)變化

孫 芳，郇 通，潘 云，李 艷*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（EZH2）與果蠅zeste 基因增強(qiáng)子同源，是多梳蛋白抑制復(fù)合物2（PRC2）蛋白復(fù)合物（Ploycmb Repressive Complex 2）的一個催化亞基，通過SET 結(jié)構(gòu)域催化組蛋白H3 賴氨酸第27 號位的三甲基化（H3K27me3），進(jìn)一步介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制〔1〕。其在疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已經(jīng)得到共識，成為當(dāng)前研究的熱點。研究表明，EZH2的過表達(dá)在許多不同類型的腫瘤中發(fā)現(xiàn)，比如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等，與腫瘤的侵襲、演化以及不良預(yù)后有關(guān)〔2-5〕。在血液系統(tǒng)腫瘤中，EZH2 的過表達(dá)已經(jīng)在成人T 細(xì)胞白血病/淋巴瘤、Burkitt’s 淋巴瘤、T/NK細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）、慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）、B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）、彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）等多種淋巴系統(tǒng)腫瘤中被證實〔6-9〕。在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，EZH2 與神經(jīng)膠質(zhì)瘤，惡性外周神經(jīng)鞘膜瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展、分級及治療密切相關(guān)〔9-10〕。盡管EZH2在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中意義重大，EZH2 致腫瘤發(fā)生的作用機(jī)制大部分仍不清楚，目前的國內(nèi)外基礎(chǔ)研究也相當(dāng)有限。我們成功建立了小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化體系，觀察EZH2 在胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中的蛋白表達(dá)變化，為以后對EZH2蛋白功能與作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗細(xì)胞系小鼠胚胎干細(xì)胞系E14Tg2A.4。

1.2 主要試劑、儀器設(shè)備及來源明膠（Millipore，ES-006-B）；DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco’s minimal essential medium，Specialty media，SLM-220-M）；胎牛血清（Hyclone，SH30071.03）；非必需氨基酸（Specialty media，TMS-001-C）；2-巰基乙醇（Specialty media，ES-007-E）；L-谷氨酰胺（Specialty media，TMS-002-C）；核苷酸（Specialty media，ES-008-D）；青霉素-鏈霉素（Specialty media，TMSAB-2C）；1 000 U/mL血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF；ESGRO，Millipore ESG1107）；胰酶（tryple express Gibco:ref:12605-028，lot:1248224）；DMSO（sigma，D2650）；DPBS（REF14190144）；維甲酸（RA，sigma，R2625-50MG）；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，fermentas）；Taq酶，F(xiàn)ast Green Master（ROX）（04913914001，Roche）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天，P0010S）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天，P0018）；EZH2一抗（BD Biosciences，612666）；EZH2 二抗（Abcam ab6709）；熒光定量PCR 儀（CFX96TMReal-Time system C1000，Bio-Rod）；ECL 化學(xué)發(fā)光（thermo，Prod#34080）；倒置顯微鏡（Primo Vert，ZEISS）；Western blot所用電泳儀等為Bio-rad公司生產(chǎn)；顯影設(shè)備為ImageQuant LAS 4000系統(tǒng)。

1.3 RA誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化實驗E14Tg2A.4 培養(yǎng)在預(yù)鋪有明膠涂層的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入DMEM 完全培養(yǎng)基：80%DMEM 培養(yǎng)基，15%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%2-巰基乙醇，1%L-谷氨酰胺，1%核苷酸，1%青霉素-鏈霉素，1 000 U/mL血病抑制因子。在鋪有明膠的10 cm培養(yǎng)皿中，DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d 后，收集細(xì)胞1.5×106，將細(xì)胞沉淀標(biāo)記為第0 天（D0），同時按照1.5×106/10 cm 培養(yǎng)皿的密度種植于 5 個 10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，在撤去LIF 的DMEM 完全培養(yǎng)基中加入維甲酸（濃度為5×10-7mol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)，其間每天換液，第5 天誘導(dǎo)結(jié)束。于誘導(dǎo)分化第1 天（D1）、第2天（D2）、第3天（D3）、第4天（D4）、第5天（D5）收集細(xì)胞沉淀，標(biāo)號。細(xì)胞培養(yǎng)期間每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照保存。

1.4 RT-PCR 在干細(xì)胞分化過程中，按固定時間收獲細(xì)胞，用TRN2ol 試劑提取RNA，然后用Super-Script III 逆轉(zhuǎn)錄酶，oligo（dT）作為引物合成cDNA，用SYBR green法作定量PCR反應(yīng)。

1.5 Western blot 將收獲的D0至D5細(xì)胞沉淀，用RIPA 裂解法制備全細(xì)胞裂解液，超聲破碎，測蛋白濃度，按照 60 μg 的上樣量進(jìn)行 Western blot，用SDS-PAGE 蛋白電泳法分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)膜的方法把蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上（轉(zhuǎn)膜條件：4 ℃，恒流，360 mA，1 h），3%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗室溫孵育 1 h，TBST 洗 3 次，5 min/次，然后二抗孵育1 h，TBST 洗 3 次，5 min/次，ECL 化學(xué)發(fā)光，孵育5 min，ImageQuant LAS 4000 系統(tǒng)顯影，應(yīng)用Image Quant TL軟件分析圖像，計算相對蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理對各組的計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS17.0軟件統(tǒng)計包進(jìn)行統(tǒng)計，多組間的比較采用方差分析，總體差異顯著后，進(jìn)行Post Hoc兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞形態(tài)上的變化形態(tài)學(xué)觀察可見，胚胎干細(xì)胞（ESCs）呈橢圓或圓形，細(xì)胞核大，核仁明顯。加入RA誘導(dǎo)1 d后，細(xì)胞逐漸變?yōu)槿切位蚨噙呅蜗蛲鈹U(kuò)展，隨后的幾天開始伸出突起，變細(xì)變長，與鄰近細(xì)胞交織成網(wǎng)，在誘導(dǎo)5 d后，形成密集的神經(jīng)樣網(wǎng)絡(luò)，神經(jīng)樣細(xì)胞多呈雙極性，胞體圓亮。整體來看，細(xì)胞形態(tài)已趨于一致。見圖1。

圖1 胚胎肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞形態(tài)變化

2.2Real-Time PCR驗證胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物和神經(jīng)細(xì)胞早期分化標(biāo)記物結(jié)果胚胎干細(xì)胞標(biāo)記Sox2、Oct3/4、Nanong 在誘導(dǎo)過程中mRNA 表達(dá)水平大幅度下降，神經(jīng)細(xì)胞早期分化標(biāo)記物Nestin、Tuj1、NeuroD、Nestin 在誘導(dǎo)過程中mRNA 表達(dá)水平大幅度上升。結(jié)合從細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和Real-Time PCR分析結(jié)果，確定小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功。見圖2～3。

圖2 胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物Sox2、Oct3/4、Nanong 在ESCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中mRNA的表達(dá)變化

圖3 神經(jīng)細(xì)胞早期分化標(biāo)記物Nestin、NeuroD、Tuj1在ESCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中mRNA的表達(dá)變化

2.3胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中EZH2蛋白表達(dá)水平變化EZH2在小鼠胚胎干細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平比較高（D0）。在撤去LIF 加入RA 誘導(dǎo)向神經(jīng)干細(xì)胞分化1 d 后，EZH2 表達(dá)水平仍然較高。在RA 的持續(xù)作用下從第2 天開始EZH2 表達(dá)水平逐漸下降，在第5天降至最低。見圖4～5。

圖4 EZH2在ESCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中蛋白表達(dá)量的變化

圖5 在ESCs向神經(jīng)細(xì)胞分化過程EZH2/β-actin相對蛋白含量的變化

3 討論

本實驗成功誘導(dǎo)了小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化，并且觀察到EZH2 蛋白在小鼠胚胎干細(xì)胞中表達(dá)水平比較高（第0天），在撤去LIF加入RA誘導(dǎo)向神經(jīng)胞分化1 d后EZH2表達(dá)水平仍然較高，在RA 的持續(xù)作用下從第2 天開始EZH2 表達(dá)水平逐漸下降，在第5天降至最低的變化?？偟膩碚f，本實驗建立了小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的體系，觀察到與神經(jīng)發(fā)育疾病相關(guān)的EZH2 蛋白在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過程中的特異性表達(dá)變化，為下一步研究EZH2的作用機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

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