反應(yīng)元件CRE和SRE參與豬CCR1和CCR5信號(hào)通路的分析

柴繼田，姜軍娜，李 棟，王建兵，周家華，李穎穎，王志強(qiáng)*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

反應(yīng)元件CRE和SRE參與豬CCR1和CCR5信號(hào)通路的分析

柴繼田1，2，姜軍娜1，2，李 棟1，2，王建兵1，2，周家華1，2，李穎穎1，2，王志強(qiáng)1，2*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

為探明調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)與分泌的趨化因子(RANTES)與趨化因子受體1(CCR1)、趨化因子受體5(CCR5)的信號(hào)通路關(guān)系，采用分子克隆技術(shù)、Western blotting技術(shù)構(gòu)建、鑒定豬CCR1和CCR5真核表達(dá)載體，通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測RANTES分別作用CCR1和CCR5后螢火蟲熒光素酶的表達(dá)量間接反映出cAMP反應(yīng)元件(CRE)和血清反應(yīng)元件(SRE)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，RANTES作用于CCR1能降低HEK293T細(xì)胞內(nèi)CRE的表達(dá)水平，對SRE有激活作用，而作用于CCR5后既能提高CRE的表達(dá)水平，也能增強(qiáng)SRE的表達(dá)。結(jié)果證明，RANTES通過CCR1受體能激活SRE，降低由毛喉素升高的CRE表達(dá)水平；RANTES通過CCR5受體對CRE和SRE均有激活作用。

RANTES；CCR1；CCR5；CRE；SRE

調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)與分泌的趨化因子(regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted，RANTES)又稱CCL5，多數(shù)組織在炎性因子等刺激下可表達(dá)RANTES，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染Marc-145后顯著上調(diào)RANTES基因的轉(zhuǎn)錄，而滅活的PRRSV不能[1]；癢病毒感染大鼠刺激腦小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANTES[2]；腸致病性大腸桿菌感染激活宿主表達(dá)RANTES[3]；體內(nèi)糖基化終產(chǎn)物可誘導(dǎo)人腎膜細(xì)胞表達(dá)RANTES[4]。RANTES對多種白細(xì)胞(如T細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和粒細(xì)胞等)具有趨化或刺激作用。RANTES受體為CCR1、CCR3、CCR4和CCR5，其中CCR1和CCR5是其高親和力受體[4-5]。T.Kato等[6]研究CRPC時(shí)發(fā)現(xiàn)在RANTES作用下通過siRNA負(fù)向調(diào)節(jié)CCR1表達(dá)檢測到ERK1/2和Rac1/cdc42磷酸化水平降低，金屬蛋白酶2和9的分泌量降低；在基質(zhì)侵染試驗(yàn)中，減少CCR1表達(dá)或阻斷ERK或Rac信號(hào)通路顯著減少侵染細(xì)胞的數(shù)量，指出RANTES與CCR1相互作用通過ERK和Rac信號(hào)通路調(diào)節(jié)金屬蛋白酶2和9的表達(dá)。朱曉波[7]在研究MIP-la/CCR5生物軸在幼鼠癲癇發(fā)生中生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)了ERK1/2信號(hào)通路等至少部分的調(diào)控癲癇發(fā)生早期階段海馬MIP-la/CCR5的表達(dá)，并指出CREB可作為MAPKs的下游信號(hào)分子而在癲癇發(fā)生中發(fā)揮作用。黃文晉[8]在研究ERK1/2、CREB和acoznin在神經(jīng)系統(tǒng)中功能時(shí)指出在神經(jīng)元可塑性中，ERK1/2可通過ERK1/2激活的Rsk蛋白激酶家族使CREB磷酸化。G.J.Babu等[9]在研究由去氧腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大情況下通過SRE/TCF途徑激活的c-fos基因轉(zhuǎn)錄情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，磷酸化的Elk-1、TCF和c-fos SRE形復(fù)合物可以激活c-fos基因轉(zhuǎn)錄，而當(dāng)ERK被選擇性抑制劑作用后Elk依賴的途徑被阻斷，說明了ERK在Elk依賴的c-fos基因轉(zhuǎn)錄中至關(guān)重要。c-fos屬于即刻早期應(yīng)答基因，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物作為一類核蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細(xì)胞生長、分裂、增殖、分化乃至程序性死亡等方面具有重要的作用，SRE轉(zhuǎn)錄控件的變化直接影響c-fos基因的表達(dá)[10-11]。

本試驗(yàn)旨在探究RANTES與豬CCR1和豬CCR5作用后細(xì)胞內(nèi)CRE和SRE控件的變化情況，為進(jìn)一步研究趨化因子受體CCR1和CCR5在豬體內(nèi)的生理作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HEK293T細(xì)胞、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院保存；新鮮豬肉從市場購買；pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]、pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro]均購于Promega公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒，由Beyotime公司生產(chǎn)；DNA提取試劑盒，北京全式金生物科技有限公司生產(chǎn)；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶，由美國Promega公司生產(chǎn)等。

1.2 主要儀器

PCR儀(AB-2720型)，由Applied Bios公司生產(chǎn)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(JY92-II DN型)，由寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)；CO2培養(yǎng)箱(HERA CELL 150i)，由Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡(AE2000)，由麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)； GluMax-Multi多模式微孔板檢測儀，由Promega公司生產(chǎn)等。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考豬的CCR5基因序列(GenBank：AB119272.1)、CCR1基因序列(GenBank：AB119268.1)設(shè)計(jì)引物。

CCR5，SenP：5′-CCCAAGCTTATGGATTA-TCAAACGACGAGTCCCTTC-3′；AntP：5′-GCT-CTAGAGCCAGGTCACAAGCCGACAGAGATT-TC-3′。CCR1，SenP：5′-CCCAAGCTTATGGAA-ACTTCAACCTCAAAG-3′；AntP：5′-GCTCTA-GATCAGTCAGAAGCCAGCAGAGAG-3′。AAGCTT是HindⅢ酶切位點(diǎn)，TCTAGA是XbaⅠ酶切位點(diǎn)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 豬CCR1和CCR5真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.4.1 克隆豬CCR1、CCR5基因 按DNA提取試劑盒方法提取豬基因組DNA，PCR使用50.0 μL反應(yīng)體系：95 ℃ 2 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，分別擴(kuò)增CCR1和CCR5基因。1%瓊脂糖凝膠電泳，并按照凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行純化回收，標(biāo)記后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-CCR5和pcDNA3.1(+)-CCR1 分別對純化后的CCR1、CCR5和pcDNA3.1(+)進(jìn)行雙酶切。100.0 μL酶切體系，37 ℃水浴3.5 h；同樣方法酶切CCR5基因和載體pcDNA3.1(+)。反應(yīng)結(jié)束后把雙酶切過的CCR1、CCR5與pcDNA3.1(+)載體進(jìn)行連接，20.0 μL連接體系：ddH2O 2.0 μL，5×T4 Buffer 2.0 μL，pcDNA3.1(+)2.0 μL，CCR1 10.0 μL，T4連接酶2.0 μL，16 ℃水浴過夜反應(yīng)；同樣的方法進(jìn)行CCR5的連接。次日，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中：涂布至含氨芐青霉素的LB平板上，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。從LB平板上挑取單個(gè)菌落4個(gè)分別接種于5 mL LB液體試管(含氨芐)中，37 ℃ 220 r·min-1振蕩培養(yǎng)至液體渾濁，保種后按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒標(biāo)記后于-20 ℃保存。

1.4.3 鑒定pcDNA3.1(+)/CCR5和pcDNA3.1(+)/CCR1

1.4.3.1 雙酶切鑒定：20.0 μL酶切體系，37 ℃水浴3.5 h后，1%瓊脂糖凝膠電泳，EB液染色15 min后用凝膠成像儀拍照記錄；同樣方法進(jìn)行pcDNA3.1(+)-CCR5的鑒定。

1.4.3.2 基因測序鑒定：經(jīng)雙酶切鑒定為陽性的樣品送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。選取測序正確的菌種加入無菌的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，參照無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒說明書提取質(zhì)粒，檢測其濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.3 Western blotting鑒定：轉(zhuǎn)染前一天，取融合率約85%的HEK293T細(xì)胞鋪6孔板，根據(jù)生長狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基的比例，使其滿足次日的轉(zhuǎn)染要求。按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，使用超聲波裂解儀裂解細(xì)胞，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?zhǔn)備相關(guān)實(shí)驗(yàn)器材，經(jīng)過SDS-PAGE和濕轉(zhuǎn)后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(1∶5 000)4 ℃過夜孵育，二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，DAB顯色。

1.5 雙報(bào)告熒光素酶檢驗(yàn)CCR1和CCR5功能活性

轉(zhuǎn)染前一天，取融合率約85%的HEK293T細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞數(shù)量鋪24孔板以使其滿足次日的轉(zhuǎn)染要求。按照目的基因質(zhì)粒∶螢火蟲熒光素酶質(zhì)?！煤ＤI熒光素酶質(zhì)粒=2∶10∶1的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作步驟參照LipofectamineTM2000說明書。轉(zhuǎn)染約18 h后加藥，作用約6 h后使用裂解液裂解收集細(xì)胞，使用微孔板多功能熒光檢測儀采集數(shù)據(jù)。每個(gè)劑量組至少3次重復(fù)，使用平均值進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié) 果

2.1CCR1、CCR5基因的的PCR擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1)顯示泳帶與預(yù)期片段(CCR1 1 062 bp，CCR5 1 059 bp)大小相符，表明擴(kuò)增片段正確，可以進(jìn)行膠回收試驗(yàn)。

1、2.CCR1和CCR5的PCR產(chǎn)物；M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1，2.PCR products of CCR1 and CCR5；M.DNA molecular weight marker圖1 CCR1和CCR5基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR products of CCR1 and CCR5

2.2 構(gòu)建的真核表達(dá)載體的鑒定結(jié)果

對構(gòu)建的真核表達(dá)載體樣品進(jìn)行雙酶切，鑒定結(jié)果(圖2)顯示：pcDNA3.1(+)-CCR1樣中的A1、A3、A4號(hào)，pcDNA3.1(+)-CCR5樣中的B3、B4號(hào)孔出現(xiàn)雙條泳帶，且泳帶大小與預(yù)期泳帶位置相符；初步判定pcDNA3.1(+)-CCR1樣中的A1、A3、A4號(hào)樣和pcDNA3.1(+)-CCR5樣中的3、4號(hào)樣真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。為了進(jìn)一步確認(rèn)目的基因的正確性，對A3、A4、B3、B4號(hào)樣進(jìn)一步測序鑒定。由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，使用Editseq和Megalign軟件分析測序結(jié)果，結(jié)果表明所構(gòu)建的目的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫序列完全相同，說明成功構(gòu)建出真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-CCR1和pcDNA3.1(+)-CCR5。

2.3 Western blotting鑒定結(jié)果

Western blotting鑒定所構(gòu)建的載體能否在真核細(xì)胞順利表達(dá)，結(jié)果(圖3) 顯示在預(yù)期位置出現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶，且條帶大小與理論相符，而未轉(zhuǎn)染組未出現(xiàn)條帶。說明所構(gòu)建的pcDNA3.1(+)-CCR1和pcDNA3.1(+)-CCR5能夠在293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

A 中1、2、3、4為pcDNA3.1(+)-CCR1酶切結(jié)果；B中1、2、3、4為pcDNA3.1(+)-CCR5酶切結(jié)果；M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A 1，2，3，4 lane is pcDNA3.1(+)-CCR1 enzyme digestion products；B1，2，3，4 lane is pcDNA3.1(+) -CCR5 enzyme digestion products；M.DNA molecular weight marker圖2 pcDNA3.1(+)-CCR1/CCR5經(jīng)HindⅢ、XbaⅠ酶切結(jié)果Fig.2 pcDNA3.1(+)-CCR1/CCR5 digested by HindⅢ and XbaⅠ

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；B.空白對照；1、2.CCR1和CCR5的蛋白質(zhì)樣品M.Protein molecular weight marker；B.Blank control；1 and 2.Protein samples of CCR1 and CCR5，respectively圖3 Western blotting蛋白質(zhì)分析Fig.3 Western blotting protein analysis

2.4 雙熒光素酶系統(tǒng)檢測結(jié)果

為了探究RANTES對CCR1、CCR5作用后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激活情況，本試驗(yàn)使用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對CCR1、CCR5進(jìn)行了試驗(yàn)，通過熒光素酶表達(dá)水平的高低間接反映RANTES對CCR1或CCR5的作用效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示(n≥3)：使用Forskolin預(yù)刺激轉(zhuǎn)染CCR1的293T細(xì)胞以提高cAMP表達(dá)水平，隨著RANTES濃度的升高，熒光值越低，即對CRE的表達(dá)具有抑制作用；RANTES濃度升高均能增強(qiáng)CRE的表達(dá)(圖4)。RANTES作用于CCR1或CCR5，隨著RANTES濃度的升高，熒光值均升高，即對SRE的表達(dá)均具有增強(qiáng)作用，但是對CCR1表現(xiàn)得更為強(qiáng)烈(圖5)。

3 討 論

圖4 RANTES分別通過CCR1和CCR5對CRE作用結(jié)果Fig.4 Effect of RANTES on CRE via CCR1 or CCR5

圖5 RANTES通過CCR5、CCR1對SRE作用結(jié)果Fig.5 Effect of RANTES on SRE via CCR5 or CCR1

RANTES的受體CCR1和CCR5屬于GPCR型受體，GPCR是細(xì)胞表面參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子中數(shù)目最龐大的一種膜受體超家族，幾乎參與了生物體所有的生命活動(dòng)。GPCR的細(xì)胞信號(hào)通路主要指cAMP信號(hào)通路和磷脂酰肌醇信號(hào)通路。在cAMP信號(hào)通路中，GPCR激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)，活化的AC可催化ATP轉(zhuǎn)化成cAMP，cAMP活化蛋白激酶A(PKA)，活化的PKA亞基能進(jìn)入細(xì)胞核，可催化cAMP 效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化，磷酸化的CREB與DNA上的CRE結(jié)合，從而激活CRE調(diào)控的基因的轉(zhuǎn)錄。在磷脂酰肌醇信號(hào)通路中，GPCR激活質(zhì)膜上的磷脂酶C(PLC-β)，使質(zhì)膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DG)，IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3配體門鈣通道結(jié)合，開啟鈣通道，使胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活各類依賴鈣離子的蛋白。在Ca2+的幫助下，DG結(jié)合并活化以非活性形式分布于細(xì)胞溶質(zhì)的蛋白激酶C(PKC)，活化的PKC可以使 TCF/ElK磷酸化，磷酸化的TCF/ElK可以激活以SRE為啟動(dòng)子的基因表達(dá)。本課題組通過構(gòu)建豬pcDNA3.1(+)-CCR5/CCR1真核表達(dá)載體和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，首次探明了RANTES作用于豬CCR1能夠降低由毛喉素(forskolin)激活的cAMP水平，而對SRE有直接激活作用；RANTES作用于豬CCR5后CRE和SRE均被激活，說明CRE和SRE參與RANTES的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，A.Banerjee等[12]對人HIV研究時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)CRE參與CCR5信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

RANTES在機(jī)體生長發(fā)育和抗病等過程中發(fā)揮著重要作用，本研究證明了反應(yīng)元件CRE和SRE元件參與了RANTES與豬CCR1、CCR5之間的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，為進(jìn)一步探究RANTES與CCR1或CCR5之間的信號(hào)通路關(guān)系以及其在豬疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

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(編輯 白永平)

Analysis of CRE and SRE Response Element in the Porcine CCR1 and CCR5 Signal Pathway

CHAI Ji-tian1，2，JIANG Jun-na1，2，LI Dong1，2，WANG Jian-bing1，2， ZHOU Jia-hua1，2，LI Ying-ying1，2，WANG Zhi-qiang1，2*

(1.VetarinaryMedicineCollegeofYangzhouUniversity，Yangzhou225009，China；2.JiangsuProvinceImportantAnimalDiseasesandZoonosesPreventionCollaborativeInnovationCenter，Yangzhou225009，China)

The aim of the present study was to explore the signaling relationship between the chemokine regulated on activation，normal T cell expressed and secreted (RANTES) and its receptors[chemokine receptor 1(CCR1) and chemokine receptor 5(CCR5)].The molecular cloning techniques and Western blotting were used to construct eukaryotic expression vectors，and then used dual luciferase report system tests to detect the expression of firefly luciferase after receptors activated or not with RANTES，to indirectly reflect the amount of cAMP response element(CRE) and serum response element(SRE) expression level.The results showed that CCR1 activated with RANTES could reduce the level of CRE expression and enhance the level of SRE expression in HEK293T cell，and CCR5 activated with RANTES could enhance the level of CRE expression and SRE expression.The results proved RANTES interacted with CCR1 could stimulate the level of SRE expression and reduce the level of CRE expression increased by Forskolin，with CCR5 could enhance the expression level of CRE and SRE.

RANTES；CCR1；CCR5；CRE；SRE

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.022

2015-04-20

江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)；教育部第46批“留學(xué)回國人員科研啟動(dòng)基金”

柴繼田(1987-)，男，安徽阜陽人，碩士生，主要從事分子獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)研究，E-mail：bigstudent@163.com

*通信作者：王志強(qiáng)，教授，E-mail：zqwang@yzu.edu.cn

S852.23

A

0366-6964(2015)09-1650-06