蘇云金桿菌和滅幼脲混劑對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)2種酶活性的影響

徐 明 徐福元 吳小芹

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153，2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

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蘇云金桿菌和滅幼脲混劑對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)2種酶活性的影響

徐 明1徐福元1吳小芹2

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153，2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

通過(guò)室內(nèi)外毒力測(cè)定和防治試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),蘇云金桿菌(Bt)+滅幼脲混劑對(duì)美國(guó)白蛾2 ～ 3代4齡幼蟲(chóng)有較強(qiáng)增效作用,在此基礎(chǔ)上分析該混劑對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶和乙酰膽堿脂酶(AChE)活力的影響。結(jié)果表明：5種濃度的Bt、滅幼脲及其混劑對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力的影響隨處理濃度增高和處理時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用越明顯，且差異極顯著，說(shuō)明Bt+滅幼脲混劑均有抑制白蛾4齡幼蟲(chóng)中腸幾丁質(zhì)酶活力的作用，是該混劑對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)提高毒殺效果的原因；5種濃度Bt+滅幼脲及其混劑處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性的影響隨處理時(shí)間的增加有先升高后降低的趨勢(shì)，36～96 h具誘導(dǎo)幼蟲(chóng)體壁AChE活性逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，96 h后活性明顯減弱， AChE活性減低后白蛾4齡幼蟲(chóng)很快死亡，對(duì)AChE活性抑制率為20.13%～90.00%，為Bt+滅幼脲混劑增效關(guān)鍵作用的另一個(gè)原因。

美國(guó)白蛾；蘇云金桿菌；滅幼脲；中腸幾丁質(zhì)酶；乙酰膽堿酯酶

美國(guó)白蛾(Hyphantriacunea)是一種非常猖獗的危險(xiǎn)性害蟲(chóng)，具有食性雜、危害大、繁殖快、易傳播等特點(diǎn)，屬世界性檢疫對(duì)象，2010年起該蟲(chóng)害在江蘇連云港、徐州、宿遷和鹽城等市爆發(fā)。目前，該害蟲(chóng)向江蘇周邊地區(qū)擴(kuò)散蔓延的勢(shì)頭仍在加劇，嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)氐某鞘芯G化、林果業(yè)和養(yǎng)蠶業(yè)等行業(yè)的發(fā)展。用蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)與滅幼脲(chlorbenzuron)混合劑防治美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)有顯著致死增效作用[1]，對(duì)美國(guó)白蛾生物、無(wú)公害防控提供了新的研究方向。中腸是昆蟲(chóng)消化吸收食料的重要場(chǎng)所，更是Bt毒蛋白和滅幼脲殺蟲(chóng)機(jī)理研究涉及的重要組織。Bt的主要?dú)⑾x(chóng)機(jī)制是昆蟲(chóng)食人毒蛋白晶體后，在中腸高pH環(huán)境和蛋白水解酶的作用下，毒蛋白晶體溶解并被激活。活化的蛋白引起中腸膜上皮細(xì)胞裂解、中腸麻痹，使昆蟲(chóng)幾天內(nèi)死亡[2]。滅幼脲主要是胃毒劑。昆蟲(chóng)取食后，首先會(huì)直接影響消化道的功能，使多種酶的活力下降，從而使昆蟲(chóng)產(chǎn)生厭食，生長(zhǎng)延緩，體重減輕[3]。幾丁質(zhì)酶(chitinase)是一類能把幾丁質(zhì)降解為N.乙酰.D.氨基葡萄糖或寡聚N.乙酰胺基葡萄糖的水解酶，可以降解幾丁質(zhì)為低分子量、可溶或不可溶的寡糖。該酶廣泛存在于各種真菌、植物、昆蟲(chóng)和魚(yú)類等生物中，催化水解昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)的酶主要是幾丁質(zhì)酶，通過(guò)阻斷幾丁質(zhì)酶，阻止昆蟲(chóng)蛻皮、化蛾和圍食膜的再生，以達(dá)到殺滅昆蟲(chóng)的目的[4]。昆蟲(chóng)體內(nèi)另一種重要的解毒酶系是以乙酰膽堿酯酶(acetylcho1inesterase，AChE)為代表的，它對(duì)分解外源毒素、維持昆蟲(chóng)本身正常的生理代謝起著重要作用。AChE是生物體內(nèi)神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中執(zhí)行重要功能的一種關(guān)鍵酶,該酶通過(guò)催化降解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)，終止其對(duì)神經(jīng)突觸后膜興奮的刺激作用，以維持神經(jīng)沖動(dòng)在生物體內(nèi)的正常傳遞[5]，該酶抑制的昆蟲(chóng)會(huì)興奮至死亡。本研究擬采用生化測(cè)定法研究其對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)中腸chitinase和體壁AChE靶標(biāo)酶活力的影響[6-8]，探討B(tài)t+滅幼脲混劑對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)的增效機(jī)制，以期為Bt+滅幼脲混劑的研發(fā)和推廣運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與供試藥劑

美國(guó)白蛾(簡(jiǎn)稱白蛾)4齡幼蟲(chóng)。

蘇云金桿菌(Bt)懸浮劑，毒力效價(jià)為8 000 IU/μL，(揚(yáng)州綠源生物化工有限公司生產(chǎn))；34%滅幼脲原藥(安陽(yáng)市瑞澤農(nóng)藥有限公司生產(chǎn))。

恒溫水浴鍋：上海申生科技有限公司生產(chǎn)；SpectraMax M2 酶標(biāo)儀：美國(guó)分子儀器公司生產(chǎn)；Heraeus biofuge 臺(tái)式高速離心機(jī)：D37520型，德國(guó)Kendrc公司生產(chǎn)；臺(tái)式低速離心機(jī)：TD5A-WS型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)；分析天平(0.1 mg)：BS110S，賽多利斯；電熱恒溫干燥箱：DHG-9070A型，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；混合球磨儀：德國(guó)萊馳 RETSCH MM400；電泳槽型號(hào)為Bio-Rad Mini Protean Tetra Cell，電泳電源為Bio-Rad PowerPac Basic。

1.2 Bt 與滅幼脲混劑對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)的室內(nèi)聯(lián)合毒力測(cè)定

1.2.1 藥劑配制

1) 單劑：將供試Bt分別等比稀釋為0.80、0.40、0.20、0.10、0.05 IU/μL和0.025 IU/μL 6個(gè)濃度；將供試滅幼脲分別等比稀釋為2.500、1.250、0.625、0.313、0.156 mg/L和0.078 mg/L 6個(gè)濃度。

2) 混劑：Bt+滅幼脲混劑是將上述2種供試單劑各減半混配后，分別將其等比稀釋為0.4 IU/μL+1.250 mg/L、0.2 IU/μL +0.625 mg/L、0.1 IU/μL +0.313 mg/L、0.05 IU/μL +0.156 mg/L、0.025 IU/μL +0.078 mg/L和0.012 5 IU/μL +0.039 mg/L 共6個(gè)濃度，聯(lián)合毒力測(cè)定方法和效果見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 供試幼蟲(chóng)取樣方法 將新鮮復(fù)葉槭樹(shù)葉片在上述配制的各濃度藥液中速浸20 s，晾干后葉片放入直徑15 cm的大培養(yǎng)皿中，每處理濃度接4齡幼蟲(chóng)30頭，以無(wú)菌水為對(duì)照，重復(fù)3次，用藥后分6、12、24、36、48、72 、96 h取樣幼蟲(chóng)供中腸Chitinase 和體壁AChE靶標(biāo)酶活力的測(cè)定。

1.3 Bt+滅幼脲混劑對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)酶活性的變化測(cè)定方法

1.3.1 中腸幾丁質(zhì)酶測(cè)定方法

1) 粗酶液的提取。中腸樣品送來(lái)時(shí)每管約為1 mL，在此管中加3個(gè)鋼珠，直接進(jìn)行球磨勻漿。球磨勻漿是將樣品(中腸或體壁)在預(yù)冷條件下進(jìn)行的。球磨條件：頻率為10次/秒，時(shí)長(zhǎng)為1 min，重復(fù)3次。勻漿液于4 ℃，12 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液即為粗酶提取液。

2) 幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定。N-乙酰葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取9支試管(標(biāo)號(hào)0，1～8)，按順序分別加入0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.12、0.16、0.20 mL和0.24 mL N-乙酰葡萄糖胺溶液，再用水補(bǔ)足到0.40 mL，加0.2 mL的飽和硼砂溶液，沸水浴7 min， 冷卻后加2 mL 冰醋酸和1 mL 1%的對(duì)二甲氨基苯醛(DMAB)溶液， 37 ℃保溫15 min 后，測(cè)定585 nm下的吸光值，其中以0號(hào)管作對(duì)照。以N-乙酰葡萄糖胺含量(μg/mL)作橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定。參照肖拴鎖等[6]的方法略作改動(dòng)，取粗酶液0.1 mL，加入乙酸緩沖液0.1 mL(0.1 mol/L，pH 5.8)，0.1 mL膠體幾丁質(zhì)，37 ℃下反應(yīng)3 h，3 000 r/min離心10 min，取0.1 mL上清液，加入0.01 mL的1%蝸牛酶，37 ℃反應(yīng)1 h，以同樣處理的包括底物和酶(加熱失活)的反應(yīng)液為對(duì)照。

測(cè)定產(chǎn)生的N-乙酰葡萄糖胺的含量。取0.1 mL上清液，加0.05 mL的飽和硼砂溶液，沸水浴7 min，冷卻后加0.5 mL冰醋酸和0.25 mL 1%的對(duì)二甲氨基苯醛(DMAB)溶液，37℃保溫15 min后，測(cè)定585 nm下的光密度。

酶活定義為在上述條件下，1 h催化生成1 μg N-乙酰葡萄糖胺的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

1.3.2 體壁AChE測(cè)定方法 測(cè)定方法參照改進(jìn)的Ellman法[7-8]，作為底物的碘化硫代乙酰膽堿被AChE分解為乙酸和硫代膽堿，硫代膽堿與DTNB作用，生成一種黃色的絡(luò)合物，在412 nm下比色。分別取0.025 mL的磷酸緩沖液(0.1 mol/L)和粗酶液加入1.5 mL Ependoff管中，充分混勻，35 ℃水浴10 min 后加入0.05 mL 碘化硫代乙酰膽堿(1 mmol/L)，反應(yīng)10 min 后加入0.9 mL DTNB-磷酸鹽-乙醇溶液顯色并終止反應(yīng)，以0.05 ml蒸餾水代替底物作為空白對(duì)照，于412 nm 下測(cè)定其光吸收值，每處理重復(fù)3次。

產(chǎn)物濃度：C=ΔOD/(ε×L)式中：ΔOD為吸光度的變化值；ε為產(chǎn)物與DTNB絡(luò)合物的摩爾消光系數(shù)，ε=13 600L/(mol·cm)；L為光程。

酶活以單位質(zhì)量體壁單位時(shí)間水解得到的產(chǎn)物的物質(zhì)的量計(jì)算，酶活性由酶促反應(yīng)的初速度來(lái)確定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.0.5進(jìn)行方差分析，用Duncan(新復(fù)極差法)分別在0.05和0.01水平下檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt+滅幼脲混劑對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)的毒力及藥效測(cè)定結(jié)果

經(jīng)室內(nèi)外毒力測(cè)定和防治試驗(yàn)結(jié)果表明，Bt+滅幼脲混劑對(duì)白蛾二代、三代4齡幼蟲(chóng)的毒力均較高，滅幼脲對(duì)白蛾二代幼蟲(chóng)的毒力指數(shù)為124.20，分別高于混劑對(duì)二代(113.07)、三代(115.48)幼蟲(chóng)的毒力指數(shù)，具有較強(qiáng)的增效作用；聯(lián)合毒力分析增效達(dá)0.76和0.83倍，有較強(qiáng)的增效作用?；靹┰谠囼?yàn)林間防治的毒殺效果和速率也要高于單劑[1]，這與岳書奎等用Bt制劑與滅幼脲3號(hào)混合防治落葉松毛蟲(chóng)(Dendrolimussuperans)二齡幼蟲(chóng)有明顯的增效作用的試驗(yàn)結(jié)果一致[9]。

2.2 不同處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力的影響

2.2.1 不同濃度Bt處理對(duì)白蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力的影響 不同濃度Bt處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，Bt處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力存在影響，其中處理6 h時(shí)對(duì)4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)該酶活力具有激活作用，處理12～24 h對(duì)4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)該酶活力具有明顯抑制作用。因此，Bt處理能有效干擾白蛾4齡幼蟲(chóng)正常的生理代謝，從而起到毒殺作用。Bt處理白蛾4齡幼蟲(chóng)后，其體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶活力呈逐漸降低趨勢(shì)，6 h處理組的幾丁質(zhì)酶活力與同期對(duì)照有明顯差異，36 h時(shí)低于同期對(duì)照，至48 h后幾丁質(zhì)酶活力除0.8 IU/μL和0.1 IU/μL處理外，其余均低于對(duì)照，差異極顯著(P<0.01)。分析結(jié)果表明，Bt處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力有抑制作用，且隨濃度增高和培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用越明顯。

2.2.2 不同濃度滅幼脲處理對(duì)白蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力的影響 不同濃度滅幼脲處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，5種濃度的滅幼脲對(duì)4齡幼蟲(chóng)的幾丁質(zhì)酶活力均存在不同程度的調(diào)節(jié)作用，其中對(duì)處理6 h時(shí)4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)該酶活力具有激活作用，處理12 h后對(duì)4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)該酶活力具有明顯抑制作用。滅幼脲處理白蛾4齡幼蟲(chóng)后，其體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶活力呈逐漸降低趨勢(shì)，處理6 h的幾丁質(zhì)酶活力與同期對(duì)照有明顯差異，36 h低于同期對(duì)照，至36 h后幾丁質(zhì)酶活力除2.5 mg/L處理外其余均低于對(duì)照，差異極顯著(P<0.01)。測(cè)定結(jié)果表明，滅幼脲處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力有抑制作用，且隨濃度增高和培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用越明顯。

2.2.3 不同濃度Bt+滅幼脲混劑處理對(duì)白蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力的影響 不同濃度Bt+滅幼脲混劑處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出，5種濃度的混劑對(duì)4齡幼蟲(chóng)的中腸幾丁質(zhì)酶活力均存在不同程度的調(diào)節(jié)作用，其中對(duì)處理6 h 時(shí)4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)該酶活力具有激活作用，處理12 h后5種濃度的混劑對(duì)4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)該酶活力具有明顯抑制作用?；靹┨幚戆锥?齡幼蟲(chóng)6 h后，其體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力呈逐漸降低趨勢(shì)，處理組的中腸幾丁質(zhì)酶活力與同期對(duì)照具有明顯差異，36 h后除0.4 IU/μL+1.25 mg/L和0.2 IU/μL +0.625 mg/L處理外，其他濃度處理的中腸幾丁質(zhì)酶活力均低于對(duì)照，差異極顯著(P<0.01)。說(shuō)明混劑處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力有抑制作用，且隨濃度增高和處理時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用越明顯。

2.3 不同處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE的影響

2.3.1 不同濃度Bt處理對(duì)白蛾幼蟲(chóng)體壁AChE的影響 滅幼脲進(jìn)入蟲(chóng)體后，很可能首先干擾了蟲(chóng)體內(nèi)的激素平衡。因體內(nèi)DNA 的合成、各種酶(包括幾丁質(zhì)合成酶)的活力都受激素的調(diào)控，因此，酶活力的改變，便打破了各種正常的生理進(jìn)程。測(cè)試結(jié)果顯示，經(jīng)5種濃度Bt處理后，除48 h外，白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性間相比均無(wú)顯著差異，但均有不同程度的變化，其中在處理48 h和96 h的時(shí)段AChE的活性達(dá)到高峰，處理間差異顯著(P<0.01)。5種濃度處理間AChE活性的變化趨勢(shì)基本一致，但處理間在36、72 、120 h時(shí)均差異不顯著，說(shuō)明5種濃度Bt處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性無(wú)明顯影響(表1)。

表1 不同濃度Bt處理白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性Tab.1 Effects of the activity of cuticle AChE on 4th instar larvae of Hyphantria cunea by different concentration of Bacillus thuringiensis treatment (mmol·min-1·g-1)

注：圖中數(shù)據(jù)經(jīng)鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法(DMRT)檢驗(yàn)在(P<0.01)水平差異顯著。

表2 不同濃度滅幼脲處理白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性Tab.2 Effects of the activity of cuticle AChE on 4th instar larvae of Hyphantria cunea by the treatment of different concentration of chlorbenzuron (mmol·min-1·g-1)

注：圖中數(shù)據(jù)經(jīng)鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法(DMRT)檢驗(yàn)在(P<0.01)水平差異顯著。

2.3.2 不同濃度滅幼脲處理對(duì)白蛾幼蟲(chóng)體壁AChE的影響 由表2可知，隨著5種濃度滅幼脲處理后時(shí)間的增加，36～96 h時(shí)，滅幼脲對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。5種濃度滅幼脲處理96 h時(shí)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性到達(dá)高峰，5種濃度滅幼脲處理96 h后白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性逐漸減弱。本研究發(fā)現(xiàn)5種濃度滅幼脲處理后，有誘導(dǎo)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性的作用，并且隨著5種濃度滅幼脲處理時(shí)間的增加，白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。經(jīng)5種濃度滅幼脲處理后，白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性變化情況不同，5種濃度Bt處理間差異顯著(P<0.01)。

2.3.3 不同濃度Bt+滅幼脲混劑處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE的影響 研究5種濃度Bt+滅幼脲混劑處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性發(fā)現(xiàn)：各處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性有誘導(dǎo)作用，并且隨處理時(shí)間的增加白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性有先升高后降低的趨勢(shì)。36～96 h時(shí)混劑處理有誘導(dǎo)幼蟲(chóng)體壁AChE活性逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，至96 h活性到達(dá)高峰，96 h后活性明顯減弱，活性減低后白蛾4齡幼蟲(chóng)很快死亡，對(duì)AChE活性抑制率為20.13%～90.00%，處理間差異顯著(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 不同濃度Bt+滅幼脲混劑處理白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性Tab.3 Effects of the activity of cuticle AChE on 4th instar larvae of Hyphantria cunea by the treatment of different concentration of the mixture of Bt and chlorbenzuron (mmol·min-1·g-1)

注：圖中數(shù)據(jù)經(jīng)鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法(DMRT)檢驗(yàn)在(P<0.01)水平差異顯著。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)室內(nèi)外毒力測(cè)定和防治試驗(yàn)結(jié)果表明，Bt+滅幼脲混劑對(duì)白蛾二代、三代幼蟲(chóng)有較強(qiáng)的增效作用。許多研究表明，藥劑處理后中腸蛋白酶的活力受到影響，嚴(yán)重時(shí)約60%的酶活力受到抑制[10],會(huì)直接影響到蟲(chóng)的取食，導(dǎo)致體重減輕，為幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育緩慢的另一個(gè)原因。昆蟲(chóng)中腸蛋白酶對(duì)Bt毒力活性的大量研究結(jié)果表明，蛋白酶直接影響蘇云金桿菌毒素蛋白的殺蟲(chóng)專一性、作用方式及抗性[11]，由于活體PuGV-Ps包涵體中堿性蛋白酶的存在，增強(qiáng)了Bt晶體蛋白的酶解活性，提高了Bt對(duì)小菜蛾的毒力[12]。在此基礎(chǔ)上開(kāi)展了Bt+滅幼脲混劑對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)的幾丁質(zhì)酶和AChE活力的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn),Bt+滅幼脲混劑對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)的幾丁質(zhì)酶活力均有較強(qiáng)的抑制作用。Bade等觀測(cè)到幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)之間的作用是一種動(dòng)態(tài)的過(guò)程，在研究中可以從幾丁質(zhì)酶活力隨著蟲(chóng)齡的變化而增加得到相應(yīng)的證明，且3齡意大利蝗(Calliptamusitalicus)在蛻皮當(dāng)天幾丁質(zhì)酶活力是2齡剛蛻皮后的近5倍[13]。昆蟲(chóng)蛻皮時(shí)約有90%的幾丁質(zhì)被降解，所以幾丁質(zhì)酶活力的大小將直接影響到昆蟲(chóng)的發(fā)育，當(dāng)幾丁質(zhì)酶活力降低到一定程度時(shí)會(huì)導(dǎo)致意大利蝗蛻皮出現(xiàn)困難并致其死亡。從試驗(yàn)結(jié)果中還可以看出,綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)對(duì)昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶的活力也有一定程度的抑制作用，但這種抑制作用不如化學(xué)農(nóng)藥顯著，據(jù)此，可以采用一定的方法將綠僵菌與昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行混配，減少藥劑的使用量，以達(dá)到對(duì)意大利蝗更理想的防治效果[14]。本試驗(yàn)Bt+滅幼脲混劑處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力也存在影響，試驗(yàn)結(jié)果表明，5種濃度的Bt+滅幼脲混劑對(duì)4齡幼蟲(chóng)的幾丁質(zhì)酶活力均存在不同程度的調(diào)節(jié)作用，其中對(duì)處理6 h 時(shí)4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)該酶活力具有激活作用，5種濃度的Bt+滅幼脲混劑處理12 h起對(duì)4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)該酶活力具有明顯抑制作用。Bt+滅幼脲混劑的幾丁質(zhì)酶活力存在顯著性差異，處理白蛾4齡幼蟲(chóng)后，其體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶活力呈逐漸降低趨勢(shì)。處理6 h的幾丁質(zhì)酶活力與同期對(duì)照有明顯差異；36 h后除0.4 IU/μL+1.25 mg/L和0.2 IU/μL+0.625 mg/L外，其他各濃度處理的幾丁質(zhì)酶活力均低于對(duì)照，其差異極顯著(P<0.01)。測(cè)定結(jié)果表明，Bt+滅幼脲混劑處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力有抑制作用，且隨濃度增高和培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用越明顯。以上分析結(jié)果可知，Bt+滅幼脲混劑處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)中腸幾丁質(zhì)酶活力存在先激活后抑制的作用，且抑制作用明顯，當(dāng)幾丁質(zhì)酶活力降低到一定程度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致白娥4齡幼蟲(chóng)的死亡。

已知馬拉硫磷主要作用于AChE靶標(biāo)酶，使AChE活性部位磷?；种破浠钚裕鹨阴Ｄ憠A在突觸間作用時(shí)間延長(zhǎng)，從而引起突觸后膜乙酰膽堿受體的超興奮，使昆蟲(chóng)痙攣死亡[15]。趙霞等發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷處理48 h后，抑制了東亞飛蝗(Locustamigratoria)AChE活性，并且隨著馬拉硫磷濃度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)[16]。不同的昆蟲(chóng)經(jīng)馬拉硫磷處理后體內(nèi)AChE活性變化情況不同，這可能與昆蟲(chóng)的處理方式和AChE活性測(cè)定方法不同有關(guān)，但對(duì)體內(nèi)AChE活性的抑制被認(rèn)為是最可能的結(jié)果，在馬拉硫磷抗性機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)AChE活性升高是造成昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的重要原因[17]。不同殺蟲(chóng)劑對(duì)AChE活性的抑制程度不同，其活性與殺蟲(chóng)劑存在明顯劑量效應(yīng)。其中敵敵畏對(duì)AChE活性的抑制作用最顯著(LC50=3.018×10-4mg/mL)，進(jìn)一步證實(shí)AChE是有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑敵敵畏主要作用靶標(biāo)。此外，擬除蟲(chóng)菊酯類(高效氯氟氰菊酯)殺蟲(chóng)劑對(duì)落葉松毛蟲(chóng)AChE活性有一定的抑制作用[18]。本研究5種濃度Bt+滅幼脲及其混劑處理對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性有誘導(dǎo)作用，并且隨處理時(shí)間的增加，白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性有先升高后降低的趨勢(shì)，36～96 h時(shí)有誘導(dǎo)幼蟲(chóng)體壁AChE活性逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，至96 h 白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性到達(dá)高峰，96 h后白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性明顯減弱，AChE活性減低后白蛾4齡幼蟲(chóng)很快死亡，各處理對(duì)AChE活性抑制率為20.13%～90.00%。但該結(jié)果沒(méi)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑敵敵畏、擬除蟲(chóng)菊酯類(高效氯氟氰菊酯)殺蟲(chóng)劑處理對(duì)其AChE活性有明顯的抑制作用[18]，本研究Bt+滅幼脲混劑處理后對(duì)白蛾4齡幼蟲(chóng)體壁AChE活性存在先誘導(dǎo)后抑制的雙重作用和AChE活性被抑制后白蛾4齡幼蟲(chóng)很快死亡的現(xiàn)象，這也是Bt+滅幼脲混劑處理后白蛾4齡幼蟲(chóng)不出現(xiàn)興奮現(xiàn)象和提高毒力和毒殺效果的原因。

隨著美國(guó)白蛾向江蘇周邊地區(qū)擴(kuò)散蔓延，嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)氐某鞘芯G化、林果業(yè)和養(yǎng)蠶業(yè)等行業(yè)的發(fā)展。Bt與滅幼脲混劑是防治該蟲(chóng)，具有生物控制、增效高效安全、可持續(xù)、無(wú)污染等特點(diǎn)，加大其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和推廣運(yùn)用，必將為控制美國(guó)白蛾的危害和擴(kuò)散蔓延發(fā)揮重要的作用。

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(責(zé)任編輯 韓明躍)

Effects of the Activity of Midgut Chitinase, Cuticle AChE on 4thInstar Larvae ofHyphantriacuneaby the Treatment of Different Concentration of the Mixture of Bt and Chlorbenzuron

Xu Ming1，Xu Fuyuan1，Wu Xiaoqin2

(1. Forestry Academy of Jiangsu Province, Nanjing Jiangsu 211153, China；2. College of Forest, Nanjing Forestry University, Nanjing Jiangsu 210037, China)

Based on the indoor virulence and field control test results showed that the mixture of Bacillus thuringiensis(Bt) and chlorbenzuron had strong synergism to the second and third generation of the larvae of Hyphantria cunea. This paper analyzed the influence on the activity of midgut chitinase and cuticle AChE on the 4thinstar larvae ofHyphantriacuneathe result as following: As the concentration increased and treatment time prolonged 5 concentrations of the mixture of Bt and chlorbenzuron treated, the midgut chitinase activity of the 4thinstar larvae ofHyphantriacuneashowed inhibitory effect more obvious and got significant differences (P<0.01). It indicated that Bt+ chlorbenzuron mixture could improved the effect to the 4thinstar larvae ofHyphantriacunea. As the treatment time increased 5 concentrations of the mixture of Bt and chlorbenzuron treated, the cuticle AChE activity of the 4thinstar larvae ofHyphantriacuneaincreased first and then decreased. From 36-96 h the mixture induced the trend of the cuticle AChE activity gradually increased and treatment to 120 h the cuticle AChE activity was significantly diminished. The inhibitory rate of the cuticle AChE activity was 20.13%-90.00%. After the cuticle AChE activity decreased the 4thinstar larvae ofHyphantriacuneadied quickly (P<0.01). It was another reason of the synergistic effect of the mixture.

Hyphantriacunea；Bacillusthuringiensis；chlorbenzuron；the midgut chitinase；cuticle AChE

2015-01-19

中央財(cái)政林業(yè)科技推廣示范資金項(xiàng)目([2014]TJS02號(hào))資助；江蘇省林業(yè)三項(xiàng)工程項(xiàng)目(lysx[2014]17)資助。

徐福元(1955—)，男，博士，研究員。研究方向：林業(yè)有害生物生物防治。Email：xufuyuan@aliyun.com。

10.11929/j.issn.2095-1914.2015.05.012

S767.3

A

2095-1914(2015)05-064-07

第1作者：徐明(1982—)，男，博士生，助理研究員。研究方向：林業(yè)有害生物生物防治。Email：xuming2009@126.com。