環(huán)肽Astin C在Caco-2細(xì)胞單層模型中吸收機(jī)制的研究

梁麗娟，黃 璐，成 思，張朝鳳，許翔鴻，張 勉

(中國藥科大學(xué) 生藥學(xué)研究室，江蘇 南京 211198)

環(huán)肽Astin C在Caco-2細(xì)胞單層模型中吸收機(jī)制的研究

梁麗娟，黃 璐，成 思，張朝鳳，許翔鴻，張 勉*

(中國藥科大學(xué) 生藥學(xué)研究室，江蘇 南京 211198)

目的：研究環(huán)肽astin C在Caco-2細(xì)胞單層模型中的吸收機(jī)制。方法：研究astin C在Caco-2細(xì)胞單層模型中的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，考察時(shí)間、藥物濃度對astin C吸收的影響。采用高效液相色譜法檢測astin C的濃度，計(jì)算其表觀滲透系數(shù)(Papp)。結(jié)果：在Caco-2細(xì)胞單層模型中，astin C的吸收隨著時(shí)間和濃度的增加藥物吸收呈近似線性增加；Papp(A→B)明顯大于 Papp(B→A)，存在方向差異性；astin C不是P-gp的底物。結(jié)論：Astin C在Caco-2細(xì)胞單層模型中的主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是AP側(cè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所介導(dǎo)的主動轉(zhuǎn)運(yùn)。

Astin C；Caco-2細(xì)胞單層模型；主動轉(zhuǎn)運(yùn)

Astin C是一類含有氯代脯氨酸(Pro)、L-α-氨基丁酸(Abu)、L-絲氨酸(Ser)、L-β-苯丙氨酸(β-Phe)和 L-allo-蘇氨酸(allo-Thr)殘基的環(huán)五肽類化合物(圖1)。目前只從菊科植物紫菀AstertataricusL.f. 的根及根莖中分離得到[1-2]。Astin C具有抗肉瘤180細(xì)胞的活性，化合物劑量為5 mg/kg 且連續(xù)給藥5天，S180細(xì)胞的生長率為46%，顯示出中等強(qiáng)度的抗腫瘤活性[3～5]。此外，astin C可顯著抑制Con A誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖(IC50=12 μM)，但對于表面活化因子CD25和CD96的表達(dá)無影響；astin C可促進(jìn)T細(xì)胞中Caspase 9和Caspase 3前體及PARP的裂解，下調(diào)Bcl-2但增加Bad的表達(dá)，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明astin C(2.4 mg/kg·d)能明顯改善TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎[6-8]。但關(guān)于astin C藥代動力學(xué)研究，尤其是吸收機(jī)制方面的研究目前尚未見報(bào)道。Caco-2細(xì)胞單層模型作為研究小腸上皮細(xì)胞藥物吸收和代謝的體外模型，已廣泛用于藥物吸收機(jī)制的研究和口服藥物的篩選[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞單層模型研究astin C的吸收機(jī)制，考察時(shí)間、藥物濃度對astin C轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，為進(jìn)一步的藥代動力學(xué)的研究提供參考依據(jù)。

圖1 Astin C的結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1 藥品與試劑

Astin C(本課題組前期研究制備，純度≥98%)，DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸、胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone，批號：SV30087)，MTT(AMERSCO，批號：0793)；水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(型號：3111)；低溫離心機(jī)(KUBOTA 3700)；倒置顯微鏡(OLYMPUS，型號：CKX31)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Epoche Biotek)，萬分之一分析天平(Mettler Toledo，型號：AL104)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Costar)；25 cm2、75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)、Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板(聚碳酯膜直徑12 mm，孔徑0.4 μm，美國Corning公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1260)。

1.3 Caco-2細(xì)胞株

Caco-2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM高糖培養(yǎng)基，其中含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸及100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素雙抗液，于37℃、含5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。用于astin C的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究時(shí)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞調(diào)整密度為1×105個 /mL，接種在12孔Transwell板上，培養(yǎng)約21 d后，當(dāng)Transwell孔上Caco-2細(xì)胞單層的跨膜電阻(TEER)>300 Ω/cm2，細(xì)胞形成緊密單層，可用于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測astin C對Caco-2細(xì)胞的抑制作用

取對數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞，接種至96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL細(xì)胞懸液，接種密度為1×105個/mL，培養(yǎng)24 h后換液。實(shí)驗(yàn)組加入濃度分別為90、120、150、180 μmol·L-1的astin C培養(yǎng)液，每濃度5孔。同時(shí)設(shè)置空白組和對照組。培養(yǎng)6 h后，每孔加0.5 mg/mL的MTT 200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，移去上清，每孔加入DMSO 200 μL，輕搖10 min，在497 nm波長處用酶標(biāo)儀測定吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)。

2.3 Astin C的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

取符合轉(zhuǎn)運(yùn)條件的Caco-2細(xì)胞單層模型，進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。用37℃的空白HBSS溶液沖洗Transwell孔3遍，第三次沖洗時(shí)將細(xì)胞與HBSS共同置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。用pH 7.4的HBSS溶液配制濃度為120、150、180 μmol/L的astin C溶液，過濾除菌。從頂端(apical side, AP側(cè))到底端(basolateral,BL側(cè))的轉(zhuǎn)運(yùn)：將藥物溶液0.5 mL加到Transwell孔的AP側(cè)作為供給池，同時(shí)將pH 7.4 的空白HBSS溶液1.5 mL加入BL側(cè)作為接收池；從BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)：將藥物溶液1.5 mL加到Transwell孔的BL側(cè)作為供給池，同時(shí)將pH 7.4 的空白HBSS溶液0.5 mL加入AP側(cè)作為接收池。分別于30、60、90、120 min從接收池(AP側(cè)或BL側(cè))吸取接收液0.2 mL，同時(shí)補(bǔ)加37℃、pH 7.4的空白HBSS溶液0.2 mL。每組平行3個孔。

2.4 樣品處理及色譜條件

將吸取的轉(zhuǎn)運(yùn)樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，用HPLC法測定astin C的含量。HPLC檢測條件：色譜柱為ZORBAX Extend-C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動相為乙腈-0.01%甲酸水(26 ∶74)；流速為0.2 ml/min；進(jìn)樣量為2 μL；柱溫為30℃；檢測波長為210 nm。

2.5 數(shù)據(jù)分析

藥物透過Caco-2細(xì)胞單層的表觀滲透系數(shù)Papp(apparent permeability coefficients)按下式計(jì)算：Papp=ΔQ/(Δt·A·C0)，其中，ΔQ(μmol)為Δt(s)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量，A(cm2)為聚碳脂膜的面積為1.12 cm2，C0(μmol/L)為藥物初始濃度。對兩組的比較采用t檢驗(yàn)，均以mean±SD表示，P<0.05為顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 Astin C對Caco-2細(xì)胞的抑制作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明，astin C在濃度為90、120、150、180 μmol/L時(shí)，Caco-2細(xì)胞存活率均在90%以上，未出現(xiàn)突然下降的情況，表明該濃度范圍的astin C對細(xì)胞均無毒副作用。

圖2 Astin C對Caco-2細(xì)胞存活率的影響(n=5, mean±SD)

3.2 時(shí)間和濃度對astin C轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

Astin C從AP側(cè)到BL側(cè)、從BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨時(shí)間和濃度的變化趨勢見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)濃度一定時(shí)，astin C的雙側(cè)累積轉(zhuǎn)運(yùn)量在2 h內(nèi)隨時(shí)間的延長而呈近似線性增加；當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間相同時(shí)，astin C的雙側(cè)累積轉(zhuǎn)運(yùn)量隨濃度(120、150、180 μmol/L)的增加而增加。方差分析結(jié)果表明，不同濃度astin C，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)存在顯著性差異，兩兩比較結(jié)果顯示，各濃度組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同時(shí)間點(diǎn)astin C AP側(cè)到BL側(cè)、BL側(cè)到AP側(cè)的透過量均存在顯著性差異(P<0.05)；任一時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)比較均具有顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明，astin C在Caco-2細(xì)胞單層模型上的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，具有相同的吸收特征，呈現(xiàn)顯著的時(shí)間、濃度依賴性。但從AP到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)速度明顯快于BL到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)速度。

通過比較雙側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp(表1)發(fā)現(xiàn)，AP側(cè)到BL側(cè)的Papp隨濃度的增大而增大，而BL側(cè)到AP側(cè)隨濃度的增加Papp的變化則不大，且各濃度Papp在兩個方向的比值Papp(BL→AP)/Papp(AL→BL)均小于1，提示攝取作用大于外排作用，存在方向差異性。

圖3 時(shí)間、濃度對astin C 從AP側(cè)到BL側(cè)、BL側(cè)到AP側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 (n=3, mean±SD)

注：“a”表示與前一時(shí)間點(diǎn)比較P<0.05，“b”表示與任一濃度組之間比較P<0.05。

表1 Astin C在不同濃度時(shí)雙向轉(zhuǎn)運(yùn)Papp值(n=3, mean±SD)

4 討 論

環(huán)肽astin C是從菊科植物紫菀(AstertataricusL.f.)中分離得到的稀有氯代環(huán)五肽類化合物的代表。前期研究發(fā)現(xiàn)該肽類化合物具有一定的抗腫瘤活性和免疫抑制活性，但也具有一定的毒性[11-12]；為了合理地開發(fā)利用，本研究通過建立Caco-2細(xì)胞單層模型，研究astin C的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特征，探討其小腸吸收的機(jī)制，為藥代動力學(xué)研究提供參考依據(jù)。

Caco-2細(xì)胞單層模型用于藥物吸收機(jī)制研究的過程中，通常用表觀滲透系數(shù)Papp來評價(jià)受試藥物經(jīng)腸道吸收的能力。本研究結(jié)果顯示，三個濃度(120、150、180 μmol/L)的astin C從AP到BL側(cè)的表觀滲透系數(shù)Papp為6×10-6～9×10-6cm/s，均大于1×10-6cm/s，說明astin C是一種吸收中等的藥物，推斷其吸收率在20%～70%之間[13]；同時(shí)，astin C的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)均具有時(shí)間、濃度依賴性；且Papp(A→B)明顯大于Papp(B→A)(三個濃度120、150、180 μmol/L的Papp(A→B)/Papp(B→A)分別為1.62、2.03、2.14)，即AP側(cè)到BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)速度明顯快于BL側(cè)到AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)速度，表明astin C可能被小腸AP側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所轉(zhuǎn)運(yùn)[14-15]。由于載體介導(dǎo)主動轉(zhuǎn)運(yùn)的共同特征是對溫度敏感，當(dāng)溫度下降時(shí)，載體的活性逐漸減弱或者失活。因此在下一步研究中，應(yīng)考察溫度對astin C吸收的影響，從而驗(yàn)證載體介導(dǎo)的主動轉(zhuǎn)運(yùn)方式是否參與其吸收過程。P-糖蛋白(P-gp)位于Caco-2細(xì)胞AP側(cè)，其作用是將細(xì)胞內(nèi)藥物外排至細(xì)胞外側(cè)，因而不利于藥物的吸收[16]。通常根據(jù)Papp(B→A)/Papp(A→B)的比值來判斷所研究藥物是否P-gp的底物。Astin C在高、中、低三種濃度時(shí)的Papp(B→A)/Papp(A→B)比值均小于1，說明astin C不是P-gp的底物，不受P-gp外排作用的影響[14-15]。

由于Caco-2 細(xì)胞模型與整體吸收具有良好的相關(guān)性，已被廣泛應(yīng)用于藥物吸收機(jī)制的研究、藥物體內(nèi)吸收的預(yù)測、新藥設(shè)計(jì)及藥物生物利用度和安全性的的評價(jià)。與動物實(shí)驗(yàn)相比，Caco-2細(xì)胞模型具有顯著優(yōu)點(diǎn)：同源性好，模型建立周期短，可以同時(shí)進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，并且從細(xì)胞水平提供腸吸收和代謝的信息。但由于Caco-2細(xì)胞來源于結(jié)腸，缺乏小腸上皮中的粘液層及腸道菌群代謝酶，因此該模型不能完全模擬藥物在小腸中的吸收過程。所以，下一步的研究應(yīng)在細(xì)胞模型研究的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)整體動物實(shí)驗(yàn)，深入探討astin C的體內(nèi)吸收和代謝過程。

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Absorption Mechanism of Astin C in Caco-2 Cell Monolayer Model

Liang Lijuan, Huang Lu, Cheng Si, Zhang Chaofeng, Xu Xianghong, Zhang Mian*

(Research Department of Pharmacognosy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)

Objective: To study the absorption mechanism of the astin C, a cyclopeptide, in Caco-2 cell monolayer model. Method: Caco-2 cell model was established to investigate the bidirectional transport of astin C. The influences of time and drug concentration on the absorption of astin C was observed. Drug concentration was measured by HPLC and the apparent permeability coefficients(Papp) was calculated. Results: The absorption of asitn C in Caco-2 cell monolayer was nearly linear increased in a time and concentration dependent manner. The value of Papp(A→B)was much greater than that of Papp(B→A) indicating astin C was not a substrate of P-gp. Conclusion: The absorption of astin C in Caco-2 cell monolayers is an active transportation mediated by transporter in the AP side.

Astin C;Cac-2 cell monolayer model;active transportation

2014-08-18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30772702)。

梁麗娟(1990—)，女，碩士研究生。研究方向：中藥藥理。 E-mail：lianglijuan1990@163.com

*通訊作者：張勉(1962—)，女，教授、博士生導(dǎo)師。研究方向：生藥活性成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 E-mail：mianzhang@126.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.02.008

R965

A

1006-9690(2015)02-0029-04